Profil cytokinique des macrophages activés par les Hospicells

Afin de déterminer la nature des monocytes/macrophages humains primaires activés par les Hospicells, nous nous sommes intéressés à leur profil de sécrétion cytokinique après 48 heures de culture en présence de milieu conditionné par les Hospicells. Une analyse à haut débit réalisée par la technique Luminex nous a permis d’étudier l’éventuelle présence de 42 cytokines et chimiokines humaines impliquées dans le recrutement et l’activation des cellules immunitaires mais aussi dans la définition du sous-type de macrophage.

Nous pouvons observer que les Hospicells entraînent la sécrétion de nombreuses cytokines associées aux macrophages M1 : IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12 (forme p40 et p70), TNF-α, IFN-α2, IFN-γ, MCP-1, IP-10 (IFN-γ-induced protein 10) et RANTES (Regulated and normal T cell expressed and secreted) (Figure 15A). Cependant, ces macrophages ainsi activés sécrètent également des cytokines régulièrement associées aux macrophages M2 et aux TAMs : IL-1RA, IL-4, IL-6, IL-8, IL- 10, VEGF, PDGF-AB et BB, TNF-α, TGF-β, MDC, MCP-1, MCP-3, eoxtaxin et Gro (213, 214, 232, 233) (Figure 15B).

Les Hospicells sont donc capables, indépendamment de tout contact cellulaire, de polariser les monocytes/macrophages humains primaires en un sous-type que nous qualifions de TAM-like, partageant des caractéristiques communes avec les macrophages de type M1 et M2. En effet, bien qu’il soit admis que les TAMs correspondent à un sous-type particulier de macrophages M2, des données récentes de la littérature s’accordent à dire qu’ils correspondraient en réalité à un phénotype hétérogène de cellules présentant des propriétés de macrophages M1 et M2 et dont les fonctions seraient pro-tumorales (234). Les TAMs constitueraient ainsi un phénotype hétérogène dont la plasticité serait soumise aux régulations du microenvironnement, permettant une activation de la progression tumorale et du processus métastatique.

Les macrophages activés par les Hospicells sécrètent de nombreuses chimiokines et cytokines impliquées notamment dans le recrutement des macrophages : MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, MCP-3, RANTES, IP-10, IL-10, VEGF et PDGF AB/BB (232, 235-240). Ces données pourraient corroborer les résultats obtenus in vivo montrant que les tumeurs ovariennes co-injectées en association avec des

Figure 15 : Profil cytokinique des monocytes/macrophages actives par les Hospicells

Des monocytes/macrophages humains primaires, des Hospicells ou des monocytes/macrophages humains primaires en présence de milieu conditionné par les Hospicells sont cultivés pendant 48 heures. Les concentrations en 42 cytokines/chimiokines humaines sont déterminées par technologie Luminex et représentées en fonction du sous-type de macrophage correspondant à leur sécrétion : M1 (A) et M2/TAM (B). Pour une homogénéité de représentation, les concentrations des cytokines suivantes ont été divisées par 10 : IL-1α, IL-12 (p40 et p70), TNF-α, IFN-γ, MCP-1, IP-10, RANTES, IL-10, PDGF AB/BB, MDC et les concentrations des cytokines suivantes ont été divisées par 100 : IL-1β, IL-6, IL-8. (Moyenne +/- Déviation Standard, * p < 0,01 comparé aux Hospicells seules ou aux macrophages seuls)

Hospicells chez la souris présentent une infiltration de macrophages significativement plus importante que les tumeurs issues de l’injection de cellules tumorales ovariennes seules (241).

Ces chimiokines ainsi produites, ainsi que les facteurs tels que Gro, eotaxin, MDC, sont également impliquées dans le recrutement d’autres leucocytes tels que les lymphocytes ou les neutrophiles (236). Les Hospicells pourraient ainsi constituer, via l’activation des macrophages, un régulateur clé dans la composition du microenvironnement immunitaire dans le cancer ovarien.

Les macrophages activés par les Hospicells sécrètent des cytokines telles que l’IL-6, l’IL-8, le TNF-α, le TGF-β et le VEGF, décrites précédemment comme impliquées dans la progression tumorale ovarienne et la chimiorésistance (introduction bibliographique, partie 2.2.2).

Nous émettons ainsi l’hypothèse que les Hospicells sont capables d’activer les macrophages en un phénotype hétérogène TAM-like. Ces macrophages ainsi activés sont capables de sécréter de nombreuses chimiokines permettant ainsi le recrutement de cellules immunitaires, notamment les macrophages, vers le site tumoral et pourraient être responsables des effets pro-tumoraux des Hospicells observés in vivo. Ces données corroborent ainsi les résultats obtenus in vivo montrant que les tumeurs ovariennes co-injectées en association avec des Hospicells chez la souris présentent une infiltration de macrophages significativement plus importante que les tumeurs issues de l’injection de cellules tumorales ovariennes seules (241).

Nous avons réalisé des expériences complémentaires visant à déterminer la capacité des Hospicells à induire la sécrétion de chimiokines dans les monocytes/macrophages. Pour des facilités de culture, nous avons utilisé des monocytes leucémiques U937 et THP1 activés 48 heures au PMA, cellules communément utilisées pour étudier la différenciation et la fonction des monocytes/macrophages. Par une méthode à haut débit permettant une détermination semi-quantitative de protéines présentes dans un surnageant de culture (membranes RayBiotech), nous avons déterminé le niveau de cytokines sécrétées par les cellules U937 et THP1 cultivées seules ou en présence de milieu conditionné par les Hospicells.

Nous pouvons observer que les Hospicells sont capables de multiplier par quatre la production de MCP-1 et d’entraîner une très forte sécrétion de MCP-2, MCP-3 et RANTES dans les cellules U937 bien que la libération de MCP-4 ne soit pas modifiée (Figure 16). Cependant, les cellules THP1 ne produisent pas ces mêmes facteurs en réponse au milieu conditionné par les Hospicells (résultats non montrés). Ces chimiokines sont hautement impliquées dans le recrutement des leucocytes tels que les monocytes/macrophages (239). Il a notamment été montré que MCP-1 pourrait contribuer à l’accumulation des TAMs dans le cancer ovarien (242). Ces chimiokines peuvent également contribuer directement à la régulation de la progression tumorale. En effet, MCP-1 peut activer de façon directe l’angiogenèse tumorale en se liant à son récepteur CXR2 sur les cellules endothéliales (243). De

même, il a été montré que RANTES peut favoriser la migration des cellules cancéreuses de la cavité buccale par l’augmentation de la production de MMP-9 et activer la progression tumorale dans le cancer du sein (244, 245).

Figure 16 : Sécrétions in vitro de chimiokines dans les interactions entre les monocytes leucémiques U937 et les Hospicells

A et B : Les monocytes leucémiques U397 activées au PMA pendant 48 heures sont cultivés seuls

(A) ou en présence de milieu conditionné par les Hospicells (B) pendant 48 heures. Les quantités relatives de MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 et RANTES sont déterminées sur membrane RayBiotech.

C : Les histogrammes représentent la quantité relative moyenne de protéines extrapolée de deux

spots révélés par autoradiographie et dont l’intensité est quantifiée par le logiciel PDQuest (BioRad) et normalisée par rapport à l’intensité des contrôles positifs. (Moyenne +/- Déviation Standard, * p < 0,001 comparé cellules U937 seules)

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De plus, les Hospicells sont capables d’activer la sécrétion, bien que de façon plus minoritaire comparé aux protéines étudiées ci-dessus, d’autres chimiokines telles que le pulmonary and activation- regulated chemokine (PARC), neutrophil-activating protein-2 (NAP-2) et I-309 impliquées le recrutement de leucocytes (résultats non montrés) (246-248).

Ces résultats confirment le rôle des Hospicells dans la composition du système immunitaire. En effet, si ces cellules ne sont à priori pas capables de sécréter des chimiokines, leur action sur l’activation des monocytes/macrophages permet d’entraîner de façon indirecte le recrutement de macrophages et d’autres leucocytes. De plus, ces effets sur l’activation des macrophages pourraient expliquer les rôles des Hospicells dans la progression tumorale ovarienne.