Production et purification de billes enrobées

Afin de déterminer si les CML peuvent être réinternalisés après leur sécrétion par les amibes, un marqueur pouvant être utilisé en microscopie à fluorescence était nécessaire. L’anticorps H36, précédemment caractérisé par Paquet et al., 2013 et dans le chapitre 2 de ce mémoire, permet de visualiser les CML en ciblant un sucre présent sur ces structures ainsi que sur la membrane plasmique des cellules (voir Figure 3.4). Toutefois, le marquage avec H36 ne permet pas de distinguer aisément les membranes internes, ce qui complique la visualisation des CML potentiellement ingérés par les cellules. Pour cette raison, il a été décidé d’utiliser des billes de polystyrène fluorescentes comme marqueurs de CML. D’une taille de 1 µm, ces billes peuvent être enrobées dans des CML lorsque les amibes les ingèrent en même temps que des bactéries digestibles. Ainsi, en exposant des amibes naïves (qui n’ont jamais été en contact avec des bactéries) à des billes enrobées purifiées, il serait possible de visualiser la potentielle internalisation de billes fluorescentes (donc de CML) par les cellules. Puisque les billes sont recouvertes d’une couche de membranes caractéristiques des CML, il était peu probable que la présence d’une particule étrangère à l’intérieur du CML affecte sa reconnaissance (si reconnaissance il y a) par les amibes.

La première étape était donc la production et la purification d’une grande quantité de billes enrobées selon le protocole présenté précédemment. Les gradients de densité permettant la séparation des diverses particules présentes dans les échantillons contenaient deux couches : la plus basse, peu concentrée, était celle correspondant aux CML non associés à des billes (CML «vides»). La couche supérieure ainsi qu’un agrégat de matériel situé légèrement plus bas étaient fortement colorés et ont été prélevés à des fins d’analyse (Figure 3.1D).

Une immunofluorescence avec l’anticorps H36 a été réalisée sur l’échantillon prélevé de la couche supérieure des gradients afin d’évaluer les proportions de billes enrobées et de billes non enrobées (billes libres). Il était particulièrement important de s’assurer de travailler avec des échantillons exempts de toute bille libre. En effet, si plusieurs billes non enrobées étaient présentes dans l’échantillon mis au contact des amibes, il serait impossible de déterminer si les éventuelles billes internalisées par les cellules étaient enrobées ou non. La question de ré-ingestion des CML par les amibes ne pourrait donc pas être résolue. Au contraire, la présence de CML «vides» dans l’échantillon n’était pas problématique puisque seules les billes fluorescentes seraient comptabilisées dans les analyses. La figure 3.2 montre les résultats de l’immunofluorescence effectuée sur les échantillons prélevés des gradients de densité. Le marquage des CML avec H36 produit un aspect en anneau tout autour de la structure alors que les billes fluorescentes sont visibles lorsqu’excitées à une longueur d’onde de 488 nm. Parmi tous les champs microscopiques observés, chaque bille était entourée d’un anneau positif à H36, donc enrobée dans des couches membranaires provenant de CML. Aucune bille libre n’a été aperçue lors des analyses en microscopie à fluorescence.

Une seconde vérification de la pureté des échantillons a été effectuée en microscopie électronique à transmission (Figure 3.3). Cette technique permet de distinguer avec précision les membranes des CML entourant les billes et ainsi apporter la confirmation ultime de l’absence de billes libres dans l’échantillon. Les champs microscopiques montraient une bonne quantité de billes enrobées parmi de nombreux CML «vides» et quelques bactéries résiduelles. Puisque ces derniers – CML comme bactéries – ne sont pas problématiques pour les tests de phagocytose de CML contenant des billes, il n’était pas nécessaire de s’en inquiéter. L’élément

important était que chaque bille présentait une ou plusieurs couches membranaires à sa surface, bien que la plupart n’étaient enrobées que par une mince bicouche lipidique. Ce fin enrobage était plutôt attendu puisque, les billes étant pratiquement aussi volumineuses que les CML qui leur servent de véhicule (environ 1 µm), il est probablement difficile pour les amibes de produire plus de membranes à l’intérieur de leurs post-lysosomes. À faible grossissement, certaines billes semblaient dénuées d’enrobage, mais une observation plus détaillée permettait de constater la présence d’un fragment de membrane attaché aux billes. Il est plausible que les frêles couches membranaires puissent se rompre lors des étapes de centrifugation nécessaires à la purification des billes enrobées. En somme, les analyses microscopiques effectuées ont permis de confirmer l’absence de billes libres dans les échantillons et ainsi procéder aux tests de phagocytose de billes enrobées.

Figure 3.2. Images en microscopie à fluorescence des échantillons de billes enrobées purifiées. Les échantillons ont été marqués à l’aide de

l’anticorps H36 ciblant l’enrobage de CML autour des billes fluorescentes. Toutes les billes visibles dans les champs microscopiques semblent entourées du marquage en anneau caractéristique de l’anticorps H36 ciblant les CML. L’enrobage autour des billes n’est pas discernable en contraste d’interférence différentiel (DIC) à cause de la grande réfringence des billes. Échelle = 5 µm.

Figure 3.3. Images en microscopie électronique à transmission des échantillons de billes enrobées et purifiées. A. Toutes les billes visibles

dans les champs microscopiques sont enrobées dans des CML (flèches). La grande majorité des enrobages autour des billes sont plutôt minces, à peine quelques couches de membranes. De nombreux CML ne contenant pas de billes sont présents dans l’échantillon. Quelques bactéries résiduelles provenant des co-cultures initiales sont également présentes (têtes d’épingle). B. Certaines billes se retrouvent dans un enrobage plus épais. C. L’enrobage autour des billes est parfois constitué d’une seule membrane (flèche) qui semble se détacher de la particule. Échelles : A = 2 µm, B = 1 µm et C = 0,5 µm.

3.3.2 Test de phagocytose par D. discoideum

Les billes enrobées par D. discoideum ont été mises en contact avec des amibes naïves de la même espèce afin de déterminer si elles seraient phagocytées par ces dernières. Après seulement 15 minutes de temps de contact, plusieurs cellules avaient déjà ingéré une bille enrobée (Figure 3.4). Le même résultat a été obtenu avec les échantillons de billes libres utilisés à titre de contrôle positif (résultats non montrés). Après 30 et 45 minutes, certaines cellules contenaient jusqu’à cinq billes enrobées dans leurs endosomes. Cette simple constatation permettait donc d’affirmer que les amibes peuvent bel et bien phagocyter leurs propres CML. L’enrobage autour des billes internalisées n’était pas toujours distinguable avec l’anticorps H36, possiblement à cause de l’interférence engendrée par le signal émis par le reste de la cellule. Cette même raison est à l’origine de l’utilisation de billes fluorescentes comme marqueurs de CML. Quant aux billes enrobées visibles dans le milieu extracellulaire, il était difficile de déterminer s’il s’agissait de celles provenant directement de l’échantillon purifié ou alors si les billes enrobées ingérées par les amibes avaient été ré-expulsées par après. En effet, la question demeurait : que deviennent les CML une fois ingérés?

Figure 3.4. Images en microscopie à fluorescence des échantillons contenant des amibes D. discoideum en présence de billes enrobées. A à C. Après un temps de contact de 30 minutes, une ou plusieurs billes

enrobées sont visibles à l’intérieur des cellules. Les billes situées dans le milieu extracellulaire présentent un enrobage positif au marquage par l’anticorps H36. En B, on distingue des marquages H36 en anneaux autour des billes à l’intérieur de la cellule (flèche) : il pourrait s’agir de l’enrobage des billes ou alors simplement de la membrane de l’endosome contenant la particule. Échelles : A à C = 5 µm.

3.3.3 Test de phagocytose par T. pyriformis

Les billes enrobées par D. discoideum ont également été présentées à une autre espèce de protozoaire, le cilié T. pyriformis. L’objectif de cette mise en scène était de déterminer si l’issue de l’interaction serait la même que celle obtenue avec les amibes, à savoir l’internalisation des CML. Cette fois-ci, par contre, les CML ne constituaient pas des particules susceptibles d’être reconnues comme faisant partie du soi par les ciliés, au contraire des amibes qui avaient elles-mêmes généré les multicouches membranaires enveloppant les billes. Les résultats de ce test sont

sans équivoque : après seulement 15 minutes de contact entre les ciliés et les billes enrobées, ces dernières se retrouvaient en grande quantité à l’intérieur des cellules (Figure 3.5). Les billes étaient regroupées en petits amas dans ce qui était fort probablement les vacuoles alimentaires des ciliés. Le même constat était applicable aux cellules ayant été confrontées à un échantillon de billes libres (résultats non montrés), ce qui laissait penser que ces protozoaires ne faisaient pas la distinction entre les billes de polystyrène et les CML d’amibes. Ainsi, il était évident que les CML pouvaient être réinternalisés par des protozoaires complètement différents de celui qui les avaient produits. Un fait intéressant à noter était le marquage H36 visible autour des billes enrobées ingérées par les ciliés, ce qui n’était pas le cas chez les amibes. L’épitope de H36 n’étant pas présent dans les cellules de T.

pyriformis, le signal émis par les CML internalisés était plus aisément distinguable

sans l’interférence provenant d’autres composantes cellulaires. Cette situation signifiait deux choses : que de simples CML «vides» pouvaient être utilisés pour visualiser leur ingestion par les ciliés, mais également qu’il était maintenant possible de connaître le sort des CML phagocytés en microscopie à fluorescence. En effet, alors que chez les amibes, il était ardu d’évaluer le devenir de l’enrobage autour des billes internalisées, le marqueur H36 allait permettre ces analyses chez T. pyriformis. Les investigations ont donc été poursuivies afin de déterminer le devenir des CML «vides» phagocytés par les ciliés. Après 45 minutes de temps de contact entre les cellules et les CML, une forte accumulation de matériel positif à H36 était visible dans les vacuoles alimentaires, signifiant une ingestion importante de CML (Figure 3.6). Plus encore, des cellules en cours de sécrétion de corps fécaux H36-positifs ont été aperçues et plusieurs de ces structures étaient visibles dans le milieu extracellulaire. Les corps fécaux ne sont pas produits en milieu axénique : ils se forment uniquement lors de l’ingestion de particules, et peuvent contenir des particules enrobées si celles-ci sont non digestibles (ex : bactéries L. pneumophila enrobées par T. tropicalis (Berk et al., 2008; Koubar et al., 2011)) ou en être dépourvus si les particules sont dégradables (ex : bactéries E. coli digérées par

Tetrahymena sp. (Berk et al., 2008)). Ainsi, les corps fécaux H36-positifs observés

contenaient-ils des CML intacts enrobés ou ces derniers étaient-ils dégradés avant leur inclusion dans les corps fécaux?

Figure 3.5. Images en microscopie à fluorescence des échantillons contenant des ciliés T. pyriformis en présence de billes enrobées. Après

un temps de contact de 15 minutes, de nombreuses billes enrobées se sont accumulées dans les vacuoles alimentaires des ciliés. Le marquage H36 de l’enrobage autour des billes parvient à pénétrer à l’intérieur des cellules. Échelle = 5 µm.

En étudiant plus attentivement l’aspect du marquage H36 à l’intérieur des corps fécaux, il a été possible d’y apercevoir les anneaux caractéristiques des CML tels qu’ils sont constatés chez les CML inaltérés (Figure 3.6B). Si les CML avaient été endommagés durant leur transit chez les ciliés, un marquage H36 plus diffus à l’intérieur des corps fécaux aurait été attendu. Au contraire, les résultats obtenus laissaient entrevoir la possibilité d’une accumulation de CML intacts à l’intérieur des corps fécaux. Pour s’en assurer, des analyses en microscopie confocale ont été effectuées de manière à obtenir une meilleure résolution de la structure interne des corps fécaux (Figure 3.7). Les images acquises à différents plans focaux à l’intérieur de ces structures ont permis de visualiser avec plus de précision les CML enveloppés. Ainsi, la présence de CML apparemment intacts dans les corps fécaux semblait un phénomène récurrent puisque des anneaux H36 étaient visibles dans la plupart des structures. L’anticorps H36 semblait toutefois marquer uniquement les

CML situés en périphérie du corps fécal : plus le plan observé était proche du centre de la structure, moins les anneaux H36 étaient distinguables et plus un marquage parfaitement sphérique autour du corps fécal était obtenu. À ce stade des analyses, il était possible que les CML les plus profondément enfouis soient plus altérés que les autres ou alors que l’anticorps n’est tout simplement pas capable de pénétrer jusqu’au centre de la structure.

Figure 3.6. Images en microscopie à fluorescence des échantillons contenant des ciliés T. pyriformis en présence de CML de D.

discoideum. A. Après 45 minutes de contact, les vacuoles alimentaires des

ciliés contiennent du matériel positif au marquage par l’anticorps H36 témoignant de l’ingestion d’une grande quantité de CML. Certaines cellules semblent en cours de sécrétion de corps fécaux fortement positifs au marquage de CML (flèche). B. Plusieurs corps fécaux sont visibles dans le milieu extracellulaire après 45 minutes de contact entre les ciliés et les CML. Il est possible de distinguer le marquage H36 en anneau caractéristique des CML à l’intérieur même des corps fécaux. Échelles : A et B = 5 µm.

Figure 3.7. Séries d’images en microscopie confocale de corps fécaux produits par T. pyriformis en présence de CML de D. discoideum après 90 minutes de contact. A et B. Les différentes tranches de 0,5 µm réalisées

par la microscopie confocale permettent de distinguer les CML enrobés dans les corps fécaux. Les CML sont marqués avec l’anticorps H36 leur donnant un aspect en anneau. En B, de gauche à droite : plus le plan focal s’éloigne du centre du corps fécal, plus les CML enrobés sont visibles distinctement. Échelles : A et B = 5 µm.

La confirmation de la structure des corps fécaux est venue des analyses en MET réalisées sur des échantillons de ciliés ayant été en contact avec des CML durant 45 ou 90 minutes (Figure 3.8). Dans les cellules provenant des échantillons de 45 minutes, les vacuoles alimentaires étaient chargées de matériel plus ou moins densément empaqueté. Au temps 90 minutes, toutes les vacuoles étaient très opaques à cause de la densité élevée du matériel. Des plans plus rapprochés des vacuoles ont permis d’y visualiser les CML compressés les uns sur les autres. Les vacuoles les plus claires contenaient une grande quantité de CML peu compactés et un espace était visible entre ceux-ci et la membrane du compartiment cellulaire. Au contraire, les vacuoles de teinte foncée étaient remplies de CML fortement comprimés qui prenaient un aspect bombé sous la pression, à la manière d’un relief en topographie. Les corps fécaux expulsés dans le milieu extracellulaire étaient à l’image des vacuoles, c’est-à-dire des structures très sphériques chargées de CML denses et compressés. En théorie, un corps fécal de 5 µm de diamètre pourrait contenir un peu plus d’une centaine de CML de 1 µm de diamètre, mais ce nombre

pourrait être beaucoup plus important compte tenu de la compression que subissent les CML. Enfin, plusieurs vacuoles alimentaires et corps fécaux contenaient ce qui semblait être une cellule bactérienne incluse au travers des CML empaquetés (Figure 3.8E et F). Il s’agissait vraisemblablement de bactéries K. aerogenes résiduelles provenant des échantillons purifiés de CML, puisque de telles cellules ont été aperçues dans les échantillons de billes enrobées (Figure 3.3A).

Toutes ces données permettent d’éclaircir le sort des CML ingérés par le cilié T.

pyriformis. Les CML internalisés se retrouvent dans une vacuole alimentaire où ils

s’accumulent par centaines. Puis, ils sont progressivement comprimés les uns sur les autres, un peu à la manière d’un compacteur à déchets, possiblement pour faciliter la formation et l’expulsion du corps fécal vers l’extérieur. Malgré la compression que subissent les CML, ceux-ci conservent relativement bien leur structure de lamelles concentriques, ce qui explique qu’il est toujours possible de distinguer les anneaux H36 en microscopie à fluorescence. En somme, loin d’être dégradés lors de leur phagocytose par les ciliés, les CML sont inclus dans des corps fécaux à l’instar de plusieurs bactéries résistantes (voir Tableau 1.1).

Figure 3.8. Images en microscopie électronique à transmission des échantillons contenant des ciliés T. pyriformis en présence de CML de

D. discoideum. (Voir page précédente) A. Après 45 minutes de contact, les

vacuoles alimentaires des ciliés sont chargées de CML. Certaines vacuoles sont très opaques à cause d’une plus grande densité de matériel (flèches) alors que d’autres sont moins engorgées (têtes d’épingle). B. Après 90 minutes de contact, toutes les accumulations de CML à l’intérieur des ciliés ont une densité de matériel élevée. C. Agrandissement de l’image en A de trois vacuoles alimentaires contenant des CML. Ceux-ci semblent être compactés progressivement à l’intérieur des vacuoles, ce qui produit différents niveaux de densité à mesure que les CML sont comprimés les uns sur les autres. D. Vacuole contenant des CML distinctement identifiables avant leur compression. E. Vacuole contenant des CML fortement compactés leur donnant un aspect en relief. F. Des corps fécaux contenant des CML compressés ont été sécrétés dans le milieu extracellulaire. Les flèches en E et F montrent des structures semblables à des bactéries ayant été enrobées dans les corps fécaux en même temps que les CML. Échelles : A et B = 10 µm, C = 5 µm, D et E = 2 µm et F = 1 µm.

Chapitre 4

Discussion générale

Le présent projet visait à élucider les mécanismes de formation et le rôle des CML chez D. discoideum, ces structures étant suspectées de contribuer à la survie bactérienne et à la propagation de certains micro-organismes pathogènes dans l’environnement. En effet, la machinerie moléculaire impliquée dans la biogenèse des CML et, par conséquent, dans le phénomène de l’enrobage de bactéries était totalement inconnue. De plus, la même incertitude prévalait en ce qui concerne l’utilité des CML dans la physiologie et l’écologie des protozoaires. Les objectifs de ce projet consistaient donc à 1) identifier et caractériser les protéines retrouvées sur les CML afin de déduire le mécanisme de leur formation et 2) vérifier si les CML peuvent être réinternalisés après leur sécrétion pour mieux comprendre leur interaction avec les protozoaires.

Pour ce faire, des échantillons purifiés de CML ont été analysés par spectrométrie de masse et quatre protéines majeures ont été identifiées : PonC, SctA, PhoPQ et CDD. Toutefois, le profil de migration du contenu protéique des CML ne contenait que très peu de bandes sur le gel SDS-PAGE, signifiant que peu de protéines majeures étaient associées à ces structures. Ce résultat n’était pas si surprenant : en effet, étant formés dans un compartiment d’origine lysosomale, les CML sont en quelque sorte des produits de dégradation. Plusieurs protéines associées aux membranes lysosomales sont donc susceptibles d’être dégradées lors de l’invagination des membranes menant à la formation des CML. Avant la présente étude, seulement une protéine, la lectine Discoidine I, avait été localisée sur les CML à l’aide d’un anticorps spécifique (Barondes et al., 1985). Cette protéine, synthétisée uniquement lors du développement multicellulaire et liant les sucres contenant du N- acétylgalactosamine ou du galactose (Rosen et al., 1973), a également été identifiée dans la matrice extracellulaire, une composante permettant l’accumulation de protéines sécrétées (Cooper et Barondes, 1984; Huber et O'Day, 2015). Par contre, les expériences réalisées au cours du présent projet n’ont permis de détecter cette protéine qu’une seule fois sur trois analyses de spectrométrie de masse,

employée par Barondes et al. Il est également possible que la majorité des CML contenus dans les échantillons purifiés soient issus de cellules végétatives n’ayant pas entrepris la synthèse de la Discoidine I.

Des quatre protéines majeures identifiées au cours de ce projet, seulement SctA a pu être confirmée sur les CML à l’aide d’une seconde méthode, en l’occurrence une immunofluorescence effectuée directement sur les CML avec un anticorps spécifique contre cette protéine. Ainsi, on ne peut pas exclure la possibilité que certaines des autres protéines identifiées soient issues de vésicules provenant de cellules éclatées qui auraient été purifiées en concomitance avec les CML. Cela reste donc à être vérifié ultérieurement. De plus, puisque le type de bactérie utilisée pour la production de CML par les amibes influence la morphologie de ces structures (Denoncourt et al., 2014), le contenu protéique pourrait également différer en conséquence. Jusqu’à présent, toutes les analyses de spectrométrie de masse ont été effectuées avec la même espèce bactérienne (K. aerogenes).