3.2.1 Cultures cellulaires et maintenances
La souche DH1-10 de D. discoideum (Cornillon et al., 2000) a été cultivée à 21°C en milieu HL5 liquide (1,43% de bacto peptone (Oxoid, Canada), 0,72% d'extrait de levure, 50 mM de maltose monohydrate, 3,6 mM de Na2HPO4 et 3,6 mM de KH2PO4,
additionné de 15 µg/mL de tétracycline) (Mercanti et al., 2006). Deux fois par semaine, des aliquotes de cellules ont été prélevées et déposées dans du milieu frais pour éviter une trop grande confluence des cellules, la concentration visée étant de 1 x 106 cellules/mL (Froquet et al., 2009).
La souche A du cilié T. pyriformis (ATCC) a été cultivée à 21°C en milieu PP liquide (2% de protéose peptone et 10 µM de FeCl3, additionné de 250 µg/mL de
streptomycine et de pénicilline G, et 1,25 µg/mL d’amphotéricine B) (Orias, 2000) ou en milieu SPP liquide (2% de protéose peptone, 0,1% d’extrait de levure, 0,2% de glucose et 33 µM de FeCl3, additionné de 250 µg/mL de streptomycine et de
pénicilline G, et 1,25 µg/mL d’amphotéricine B) (Gorovsky et al., 1975). Le milieu SPP a été utilisé lorsqu’une croissance rapide des ciliés était nécessaire. Pour les maintenances, des aliquotes de cellules ont été prélevées et remises en culture dans du milieu frais à raison d’une ou deux fois par semaine.
Les bactéries K. aerogenes (fournies par P. Cosson, Université de Genève, Suisse) ont été décongelées à partir d’une culture conservée à -80°C par inoculation d’un milieu Lysogeny Broth (LB) agar (37 g/L, EMD Millipore) ou Tryptic Soy Agar (TSA) (40 g/L, EMD Millipore). Les géloses ont ensuite été incubées à 37°C durant 24h.
3.2.2 Production et purification de CML et de billes enrobées
Les CML ont été produits et purifiés en grandes quantités à partir d’une co-culture de
D. discoideum et de K. aerogenes, une bactérie digestible à Gram négatif, selon le
protocole établi par Paquet et al. (Figure 3.1) (Paquet et al., 2013). Ce protocole a également été adapté pour la production de billes de polystyrène fluorescentes enrobées dans des CML.
Sur une gélose HL5 agar de 15 cm de diamètre, 2 x 106 amibes et 800 µL d’une
culture de K. aerogenes à une densité optique de 1 ont été étendues à l’aide d’un râteau stérile. Pour la production de billes enrobées, les quantités étaient de 2 x 106
amibes, 750 µL de K. aerogenes et 50 µL de billes de polystyrène fluorescentes de 1 µm (concentration à 2,65%, Polysciences Inc.). La co-culture a ensuite été incubée à 21°C jusqu’à ce que le tapis bactérien soit entièrement phagocyté par les amibes (typiquement 6 jours). La biomasse obtenue sur la gélose a été récoltée et remise en suspension dans 20 mL de tampon starvation (2 mM de Na2HPO4, 14.7 mM de
KH2PO4, 100 mM de D-sorbitol, 100 µM de CaCl2 et 1% de HL5) (Smith et al., 2010).
Les CML ont été solubilisés par inversion pendant 2 heures puis le tout a été centrifugé 5 minutes à 450 x g pour séparer les CML des amibes, celles-ci se retrouvant dans le culot résultant. Le surnageant a ensuite été récolté et une portion de 10 mL a été mélangée à 5 x 107 amibes et 10 mL de tampon starvation dans une
fiole Erlenmeyer en verre stérile. Après une incubation de 24 heures à 21°C avec agitation à 200 RPM, le milieu a été de nouveau centrifugé 5 minutes à 450 x g pour conserver uniquement le surnageant contenant les CML. Pour concentrer et séparer les CML d’éventuelles bactéries résiduelles, une aliquote de 1 mL de surnageant a été déposée sur un gradient de densité au bromure de sodium (six couches de 1 mL d’une densité allant de 1,0 à 1,5 g/mL) formé dans un tube en verre (13 x 1 cm) à l’aide d’une seringue et d’une aiguille 18G. Après une centrifugation de 45 minutes à 3220 x g, différentes couches étaient visibles dans le gradient de densité (Figure 3.1). L’agrégat jaunâtre correspondant à la portion de CML purifiés a été prélevé avec une pipette Pasteur et déposé dans un tube de 1,5 mL. Pour les échantillons contenant des billes de polystyrène, les deux autres couches visibles dans le gradient ont été prélevées pour analyse. Enfin, les CML purifiés ont subi deux lavages avec du tampon PBS (1,9 mM de NaH2PO4, 8,1 mM de Na2HPO4 et 154
mM de NaCl, pH ajusté à 7,3) en les centrifugeant 10 minutes à 17 000 x g entre chaque lavage. Chaque échantillon de CML a été conservé à 4°C dans 200 µL de PBS. Les billes enrobées purifiées ont été marquées par immunofluorescence pour l’observation au microscope à épifluorescence et ont été préparées pour la microscopie électronique à transmission (MET) (voir plus loin).
Figure 3.1. Protocole de purification de CML produits par D.
discoideum. A. Illustration des différentes étapes du protocole de purification
des CML et des billes enrobées. B et C. Plusieurs couches d’échantillon sont visibles après la centrifugation des tubes de gradient. L’agrégat jaunâtre correspondant aux CML purifiés est encerclé en blanc. D. Les échantillons de billes enrobées purifiées se retrouvent dans la couche supérieure ainsi que dans l’agrégat situé un peu plus bas dans le gradient (flèches). Figure modifiée et reproduite de Paquet et al., 2013.
3.2.3 Test de phagocytose par D. discoideum
Des amibes D. discoideum ont été mises en contact avec des billes enrobées purifiées à partir d’une co-culture de D. discoideum et de bactéries K. aerogenes. Les cellules issues des tests de phagocytose ont été analysées en microscopie à fluorescence et en MET. Pour ce faire, des aliquotes de 10 µL de billes enrobées ou de billes libres diluées 1/200 (contrôle négatif) ont été déposées sur des lamelles de microscope placées dans une plaque de 6 puits. Par la suite, 450 µL de milieu HL5 contenant 1 x 106 amibes/mL ont été ajoutés sur les lamelles pour permettre le
contact entre les billes et les cellules. Le tout a été incubé pour 15, 30 ou 45 minutes à la température de la pièce. Le milieu déposé sur les lamelles a été retiré par aspiration et les cellules adhérées ont été marquées par immunofluorescence (voir la section 3.2.5 pour le protocole).
3.2.4 Test de phagocytose par T. pyriformis
Le cilié T. pyriformis a été confronté à des CML de D. discoideum, des billes enrobées par D. discoideum et des billes libres, et les échantillons de cellules ont été marqués par immunofluorescence et préparés pour l’observation en MET. Des aliquotes de 200 µL de milieu Plate Count Broth (PCB) (0,5 % d’extrait de levure, 1% de tryptone et 0,2% de dextrose) contenant 1 x 106 cellules/mL ont été mélangées à
20 µL de CML, de billes enrobées ou de billes libres diluées 1/200 dans des tubes de 1,5 mL. Les cultures ont été incubées pendant 15, 30, 45 ou 90 minutes à la température de la pièce avec inversion des tubes. Enfin, 500 µL de paraformaldéhyde 8% (protocole d’immunofluorescence) ou de solution de fixation 2X (protocole de préparation des échantillons pour la MET) ont été ajoutés aux tubes.
3.2.5 Immunofluorescence
Les échantillons de billes enrobées purifiées, dilués 1:3 dans du PBS, ont été déposés pendant 1 heure sur une lamelle de microscope (22 mm x 22 mm) placée dans un puits d’une plaque de 6 puits. Le milieu a ensuite été retiré des puits par aspiration et le matériel adhérant aux lamelles a été fixé durant 30 minutes avec 500 µL de paraformaldéhyde 4%. Pour les tests de phagocytose par D. discoideum, la solution de paraformaldéhyde était ajoutée directement après le test et le retrait du milieu présent sur les lamelles. La solution de fixation a été retirée par aspiration et les puits ont été lavés avec 2 mL de PBS contenant 40 mM de NH4Cl, puis avec 2
mL de PBS. Les échantillons ont ensuite été perméabilisés avec du méthanol froid pendant 2 minutes et les lamelles ont été immergées dans le PBS de nouveau. Le PBS des puits a été remplacé par 2 mL de PBS contenant 0,2% de BSA (PBS-BSA) pour une incubation de 5 minutes. Les lamelles ont été transférées dans une nouvelle plaque de 6 puits sèche et incubées avec 100 µL de la solution d’anticorps
primaire (IgG de souris H36 ascite (Mercanti et al., 2006), dilution 1 : 1000 dans du PBS-BSA) pendant 45 minutes. Les puits ont été rincés trois fois avec 1 mL de PBS- BSA, le dernier rinçage étant d’une durée d’au moins 5 minutes. Les lamelles ont été transférées dans une nouvelle plaque sèche et incubées avec 100 µL de la solution d’anticorps secondaires (IgG anti-souris Alexa Fluor 568 ou Alexa Fluor 488 (Invitrogen), dilué 1 : 400 dans du PBS-BSA) pendant 30 minutes à l’abri de la lumière. De nouveau, les puits ont été rincés trois fois avec 1 mL de PBS-BSA en calculant 5 minutes pour le dernier lavage. Le milieu a été remplacé par 2 mL de PBS puis les lamelles ont été montées sur des lames de microscope (25 X 75 X 1 mm) avec 10 µL de Prolong Gold (Invitrogen). Les lames ont été scellées avec du vernis à ongles et conservées à 4°C. Les échantillons ont été observés au microscope à épifluorescence Axio Observer Z1 (Carl Zeiss) ou au microscope confocal inversé LSM 700 (Carl Zeiss).
Pour les échantillons provenant des tests de phagocytose par T. pyriformis, les mêmes étapes du protocole d’immunofluorescence ont été effectuées, mais en utilisant des tubes de 1,5 mL comme supports et en centrifugeant 5 minutes à 17 000 x g entre chaque étape.
3.2.6 Microscopie électronique à transmission (MET)
Les échantillons de billes enrobées purifiées et ceux provenant des tests de phagocytose par D. discoideum et T. pyriformis ont été préparés pour l’observation en MET. Les divers échantillons ont été fixés pendant 3 heures dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1M à pH 7,3 contenant 2% de glutaraldéhyde et 0,3% de tetroxyde d’osmium (solution de fixation). Le matériel a ensuite subi trois lavages de 10 minutes dans le tampon cacodylate de sodium puis a été déshydraté dans une succession de bains d’éthanol (5 minutes dans l’éthanol 30%, 5 minutes dans l’éthanol 50%, 5 minutes dans l’éthanol 70%, 10 minutes dans l’éthanol 95% et 1 heure dans l’éthanol 100%). Les échantillons ont été enrobés dans de la résine Epon en présence d’oxyde de propylène (pour les échantillons ne contenant pas de billes de polystyrène) ou d’éthanol 100% (pour les échantillons contenant des billes). Dans le premier cas, les échantillons ont été lavés deux fois 30 minutes dans le solvant d’oxyde de propylène, suivi d’un bain Epon : oxyde de propylène (1 :1)
durant 24 heures, de l’évaporation du solvant et d’un nouveau bain d’Epon pendant 24 heures. Dans le second cas, des bains successifs de 2 heures dans de l’Epon : éthanol 100% de différents ratios (1 :2, 1 :1, 2 :1, 3 :1 et 4 :1) ont été réalisés, suivi d’un dernier bain d’Epon durant 24 heures. Les échantillons ont ensuite été incubés 24 heures à 37°C puis trois jours à 60°C pour permettre la polymérisation de la résine à la suite de quoi de fines tranches d’échantillon (60 à 80 nm d’épaisseur) ont été coupées. Ces dernières ont été colorées au citrate de plomb 0,1% pendant 8 minutes puis à l’acétate d’uranyle 3% pendant 5 minutes sur des grilles de nickel. Enfin, les échantillons ont été observés au microscope électronique à transmission JEOL JEM-1230 à 80 kV.