2.2.1 Production d’exosomes
Dans le but d’éviter une contamination par des exosomes de SVF, le milieu de culture des cellules productrices est retiré, les cellules lavées au PBS 1X, puis le milieu changé pour
Matériels et Méthodes
un milieu de culture non supplémenté en SVF. Les surnageants de culture sont récupérés après une durée comprise entre 1 h et 48 h, dans la majorité des cas, 24 h. Les exosomes sont récoltés dans ces surnageants comme indiqué ci-après.
2.2.2 Collecte d’exosomes
La collecte d’exosomes se fait par centrifugations différentielles. Le surnageant de culture est d’abord centrifugé 10 min à 2000 g à 4◦C, puis 20 min à 20 000 g à 4◦C, il est ensuite filtré sur une membrane poreuse (pores de 0, 2 µm de diamètre), et enfin ultracentrifugé 2 h à 150 000 g à 4◦C(Ultracentrifugeuse Beckman avec rotor SW41 ou SW32, Beckman). Une étape de lavage peut être ajoutée suite à cette dernière étape, le culot enrichi en exosomes est alors remis en suspension dans du PBS 1X et centrifugé 2 h à 150 000 g à 4◦C. Les culots d’exosomes sont ensuite repris dans du PBS 1X ou directement dans du tampon Laemmli 1X.
Pour une plus grande pureté des exosomes, il est possible de les fractionner en réalisant un gradient continu de sucrose allant de 8% à 60% de sucrose (0,3 M à 1,4 M de sucrose dans de l’imidazole 3 mM pH 7,4).
Gradient classique : le gradient de 10 mL est coulé dans un tube Beckman SW41 à l’aide d’une pompe qui dépose les densités de sucrose directement au fond du tube et en continu, des moins denses (8% de sucrose), aux plus denses (60% de sucrose). Les densités les plus faibles remontent petit à petit à la surface pour donner un gradient de densité continu. Les échantillons repris dans 200 µl de sucrose 8% sont déposés à la surface du gradient puis le tube est ultracentrifugé à 100 000 g pendant 18 h.
Gradient inverse : Les échantillons d’exosomes sont repris dans 300 µl de sucrose 60% et sont déposés au fond d’un tube Beckman SW41. Le gradient de 10 mL est coulé au dessus de cet échantillon à l’aide d’une pompe équipée d’une sonde qui dépose les densités de sucrose en continu, des plus denses (40% de sucrose) aux moins denses (8% de sucrose), à la surface du liquide. Ainsi, les densités les plus fortes restent au fond et les plus faibles densités dans le haut du gradient, le tout s’équilibre naturellement pour donner un gradient de densité continu. Le tube est ensuite ultracentrifugé à 100 000 g pendant 18 h.
Après ultracentrifugation des gradients, des fractions de 1 mL (10 à 11 fractions, la fraction 1 étant la moins dense) sont prélevées. Leur densité en sucrose est vérifiée à l’aide d’un réfractomètre, puis chacune est diluée dans 10 mL d’imidazole 3 mM pH 7,4 et ultracentrifugée
Matériels et Méthodes à 100 000 g pendant 1 h.
Les culots de chaque fraction sont ensuite repris directement dans du tampon Laemmli pour être analysés en Western Blot. Pour les culots d’exosomes destinés à être dosés au Nanosight ou transfectés sur cellules en culture, les culots des fractions proches de 30% de sucrose sont mélangés. Ce sont généralement les fractions 4, 5 et 6 dans le cas d’un gradient classique, et les fractions 5, 6 et 7 pour un gradient inverse, qui contiennent les exosomes.
2.2.3 Microscopie électronique
La qualité des préparations d’exosomes peut-être vérifiée par microscopie électronique à transmission qui permet de conclure sur l’intégrité des vésicules et sur le niveau et la nature des contaminations environnantes.
Les culots d’exosomes sont resuspendus dans 50 à 100 µl de PFA (Paraformaldéhyde) 2%. 5 µl de la suspension sont alors déposés sur la membrane d’une grille préalablement recouverte de formvar-carbone. Les grilles sont laissées 20 min dans un environnement sec pour permettre à la membrane d’adsorber la suspension puis lavées au PBS 1X, et transférées dans du glutaraldéhyde 1% pendant 5 min pour permettre la fixation. Après un lavage à l’eau distillée, les objets sont imprégnés d’uranyl oxalate puis de méthyl cellulose-UA (100 µl d’uranyl acétate 4% et 900 µl de méthyl cellulose 2%) pendant 10 min sur la glace. Le surplus de liquide est enlevé à l’aide de papier Whatman, et les grilles sont ensuite séchées à l’air libre. L’observation se fait au microscope électronique à transmission (JEOL 1200EX) à 80 kV (Théry et al., 2006).
2.2.4 Quantification des exosomes au Nanosight
Les culots d’exosomes obtenus par ultracentrifugation sont resuspendus dans 500 µl de PBS 1X stérile. Si nécessaire les échantillons peuvent être ensuite dilués pour obtenir une concentration optimale de dosage proche de 108 exosomes/mL.
Les 500 µl d’échantillons contenant les exosomes sont ensuite injectés dans la « chambre optique » de l’appareil Nanosight LM10. Cet appareil est composé d’un microscope optique conventionnel équipé d’une caméra, ainsi que d’une source laser de 640nm. La diffusion du laser engendrée par la présence de petites particules de diamètre compris entre 30 et 500 nm est détectée et permet la quantification des particules présentes dans l’échantillon étudié.
Grâce à la caméra une séquence d’acquisition de 30 s à température ambiante est réalisée. Après avoir réglé les trois paramètres « brightness », « gain » et « blur » respectivement
Matériels et Méthodes
de 3 à -6, de 0,5 à 2,0 et de 3x3 à 5x5, les séquences d’acquisition sont traitées grâce au logiciel NTA Build 0329 software (version 2.0) qui permet de calculer la taille des particules en présence grâce à la mesure de leur mouvement Brownien.
2.2.5 Diffusion dynamique de lumière (Dynamic Light Scattering, DLS)
Les culots d’exosomes obtenus par ultracentrifugation sont resuspendus dans 500 µl de PBS 1X stérile. Les 500 µl d’échantillons contenant les exosomes sont ensuite transférés dans un tube à hémolyse placé au centre du dispositif composé essentiellement d’un laser et d’un détecteur de photon. L’échantillon est illuminé par un rayon laser et les fluctuations de l’angle de diffusion de la lumière sont détectées par le détecteur de photon. Après analyse des résultats par le logiciel (AVL-7004), on obtient une courbe de distribution de la taille des particules et une intensité de signal proportionnelle au nombre de particules présentes dans l’échantillon, ce qui permet une comparaison relative du nombre de particules dans un échantillon par rapport à un autre.
2.2.6 Quantification des exosomes au qNano
Les échantillons d’exosomes sont repris dans du PBS 1X et placés dans la cage de Faraday de l’appareil qNano (IZON). La concentration et la taille des exosomes de chaque échantillon sont ici mesurées en utilisant le principe de Coulter. Les exosomes passent à travers un nano pore et le passage de chacun génère un signal qui est enregistré. La magnitude de chaque signal renseigne sur la taille de la particule en question et la fréquence d’enregistrement de ces signaux est directement proportionnelle à la concentration de l’échantillon mesuré. La mesure de standards permet donc d’obtenir une valeur réelle de taille et de concentration des particules (ici des exosomes) pour chacun des échantillons.
2.2.7 Western blot
Les échantillons protéiques sont préparés à partir de culots de cellules, ou de culots d’exo-somes. Pour les échantillons cellulaires, une lyse est réalisée avec le tampon de lyse (Promega) auquel sont ajoutées des anti-protéases (Roche), ou à l’aide de 500 µl de tampon de lyse RIPA (RIPA : 1% de NP-40 ; 0,5% de Désoxycholate ; 0,1% de Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) ; 150 mM de NaCl). Les tubes sont placés sur la glace pendant 30 min et vortexés toutes les 5
Matériels et Méthodes min. Le tout est ensuite centrifugé 10 min à 10 000g et à 4◦C pour récupérer le surnageant contenant les protéines. Les échantillons sont stockés à -20◦C.
Les échantillons cellulaires, dosés par la méthode de Bradford, sont préparés dans du tam-pon Laemmli (Laemmli, 1970) en quantité protéique à peu près égale : 10 µg pour les cellules ou la totalité des exosomes contenus soit dans un culot 100 000g, soit dans un input de 10% d’un gradient de sucrose, soit dans chaque fraction d’un gradient de sucrose. Les échantillons préparés sont chauffés à 100◦C pendant 10 min puis déposés sur un gel de polyacrylamide 10%. La migration est réalisée dans du tampon de migration sous 90 Volts, 51,5 mA jus-qu’à ce que les échantillons aient atteint le gel de séparation, puis sous 130 Volts, 51,5 mA pendant environ 90 min. Une fois la migration terminée, une étape de transfert semi sec est réalisée sous 20V à ampérage constant de 500mA pendant 90min. Elle permet le transfert des protéines du gel de polyacrylamide vers une membrane PVDF (Polyvinylidene difluoride, GE, UK) immergée 10 secondes dans de l’isopropanol pur puis 30 minutes dans le tampon de transfert préalablement au transfert. L’efficacité du transfert est vérifiée en colorant la membrane au rouge ponceau et le gel au bleu de Coomassie.
Tampon Laemmli 2% de SDS ; 10% de Glycérol ; 62,5 mM de Tris HCl
au pH 6,8 ; 5% de β-mercapto-éthanol ; 0,002% de Bleu de Bromophénol
Tampon de migration 250 mM de Tris HCl ; 192 mM de Glycine ; 0,1% de
SDS (p/v)
Tampon de transfert 25 mM de Tris HCl ; 192 mM Glycine ; 10%
d’isopro-panol ; 0,04% SDS (p/v)
TBST (Tris Buffer Saline Tween) 20 mM de Tris HCl au pH 7,6 ; 0,8% de NaCl (p/v)
Les membranes sont ensuite mises à équilibrer et saturer dans la solution de TBST Lait 5% (Tris-Buffered Saline Tween) pendant 30 minutes à température ambiante, puis transfé-rées dans du TBST Lait 5% contenant l’anticorps primaire à la bonne dilution (tableau 1), et laissées avec agitation à température ambiante pendant une heure ou bien en chambre froide (4◦C) une nuit. Après trois lavages de 10 minutes dans du TBST 0,1%, la membrane est incubée 1 heure avec agitation à température ambiante dans du TBST Lait 5% contenant l’anticorps secondaire couplé à la HRP à la bonne dilution (tableau 1). S’ensuivent alors six lavages de 5 minutes dans le TBST 0,1%. Les membranes sont incubées dans le réactif chi-mio luminescent ECL (Enhanced Chechi-mioluminescence, Millipore) pendant 1 minute dans le noir puis leurs signaux luminescents sont révélés en chambre noire ou au Chemidoc (Biorad, Hercules, CA). Les signaux sont analysés avec le logiciel Image Lab (Bio-Rad) ou le logiciel Image J.
Matériels et Méthodes Nom Espèce PM (kDa) Dilution utilisée Fournisseur Référence Anticorps anti-Flotilline 1 Souris (mono-clonal) 48 1/1000 BD Trans-duction Lab 610820 Primaires anti-Alix Lapin (polyclo-nal) 91-93 1/10000 Covalab Pab0204 Table 1 – Anticorps