Contenu ARNm

Tout comme le contingent microARN des exosomes de cellules U87 et HA, le contingent ARNm de ces mêmes exosomes a été analysé. Ce contenu en ARNm a été étudié pour les exosomes produits en 24h par les cellules U87 et HA, les modèles cellulaires sélectionnés précédemment. Les ARN des exosomes des cellules productrices ont été extraits et la fraction longue de ces ARN a été purifiée pour cette étude. Les ARN longs des échantillons exosomaux ou cellulaires ont été préparés en triplicats et hybridés sur puces Affymetrix HgU133Plus2. Les profils ARNm cellulaires et exosomaux des types cellulaires HA et U87 sont ensuite comparés.

Tout comme leurs profils microARN, les profils des probesets Affymetrix d’ARNm des cellules HA et U87 (Figure 31 a) montrent des différences marquées. 8198 ARNm sont com-muns mais 1828 sont spécifiques des cellules de HA et 2194 spécifiques des cellules U87. Les profils des probesets Affymetrix d’ARNm des exosomes sont moins nombreux, seulement 311 et sont tous détectés dans les cellules HA et U87. Ces 311 probesets d’ARNm détectés

Résultats

1828 8198 2194

(a) Cellules HA et U87

1828 8180 2194

18

(b) Cellules HA et U87 et leurs exosomes

Figure31 – Diagramme de Venn des probesets Affymetrix d’ARNm exosomaux et cellulaires des cellules U87 et HA

Les cercles vert foncé représentent le nombre de probesets détectés dans les cellules HA Le cercle vert pâle représente le nombre probesets détectés dans les exosomes de HA Les cercles bleu pâle représentent le nombre probesets détectés dans les cellules U87 Le cercle bleu foncé représente le nombre probesets détectés dans les exosomes de U87

dans les exosomes de HA ou de U87 ont ensuite été recherchés sur la base de donnée Adapt (http ://bioinformatics.picr.man.ac.uk/adapt/Welcome.adapt) qui permet de cartographier les probesets Affymetrix dans les bases de données de séquences d’ARNm et d’ADNc RefSeq et Ensembl et de valider les probesets ayant une signification biologique suffisante. Dans notre cas seuls 18 probesets sont validés (Figure 31 b).

Ces 18 probesets correspondent aux 18 ARNm dont les intensités sont représentées sur la figure 32.

La première information qui se dégage de la figure 32 est le fait que les ARNm détectés à la fois dans tous les échantillons ont un profil cellulaire très similaire avec des intensités de détection toujours très fortes. Un seul ARNm, MT2A est abaissé d’environ 5,8 fois (soit 2,5 en log2) dans les cellules HA par rapport aux cellules U87. La deuxième information est que les intensités de détection de 15 de ces ARNm sont plus fortes d’un facteur moyen de 5 pour les exosomes de HA que pour les exosomes de U87. Par contre, les ARNm ANP32B et RAB13, ils sont aussi bien détectés à la fois dans les exosomes de U87 et de HA. De plus, leurs intensités de détection dans les exosomes sont au même niveau que pour les échantillons cellulaires et ces 2 ARNm semblent donc chargés en forte quantité dans les exosomes. Enfin, MT2A est lui mieux détecté dans les exosomes de U87 que dans les exosomes de HA d’un

Résultats MT2A RAB13 RPL32 RPL37A RPL39 RPL41 RPL9 RPLP0 RPLP1 RPS4X RPS6 TMSB10 TPT1 213801_x_at 214003_x_at ANP32B ATP5E EEF1A1 0 5 10 15 cell.HA cell.U87 exo.HA exo.U87

Figure 32 – ARNm exosomaux et cellulaires des cellules U87 et HA

Le cercle vert foncé représente les intensités d’ARNm détectés dans les cellules HA Le cercle vert pâle représente les intensités d’ARNm détectés dans les exosomes de HA Le cercle bleu pâle représente les intensités d’ARNm détectés dans les cellules U87 Le cercle bleu foncé représente les intensités d’ARNm détectés dans les exosomes de U87 Les intensités sont représentées en log2.

facteur 2 environ (soit environ 1 en log₂) ; il est cependant en quantité plus faible dans les exosomes de U87 ou de HA que dans les cellules U87 et HA.

Le contenu des ARNm messagers dans les exosomes diffère donc pour les cellules HA et U87. En effet si ce sont les mêmes ARNm qui sont présents dans les exosomes, leurs quantités respectives sont majoritairement plus fortes dans les exosomes de HA que dans ceux de U87. En revanche, le contenu en ARNm des exosomes à l’exception de ANP32B, RAB13 et MT2A semble plutôt bien refléter le contenu cellulaire des cellules sécrétrices.

Le contenu des ARNm dans les exosomes semble donc lui aussi régulé, mais à moindre mesure que le contenu en microARN.

3 Contrôle expérimental de la sécrétion des

ARN exosomaux

Le chargement du contenu des exosomes et leur sécrétion par les gliomes semble être un mécanisme actif puisque le contenu ARN des exosomes ne reflète pas celui de la cellule qui les a produits. Ce mécanisme est donc probablement régulé. Pour montrer l’existence d’une telle régulation, il faut envisager de provoquer in vitro une dérégulation de cette sécrétion d’exosomes et de leurs contenus en ARN. Cette potentielle dérégulation a été testée en sou-mettant les cellules de glioblastomes U87 à deux éléments de stress extérieur, l’hypoxie d’une part et l’utilisation de molécules inhibitrices d’autre part.

3.1 L’hypoxie affecte la sécrétion d’exosomes par les cellules

de U87

Le premier stress à avoir été testé est l’hypoxie. En effet, il est classiquement admis que lors de la prolifération des tumeurs, les cellules au centre de la masse tumorale sont de moins en moins bien oxygénées et connaissent ainsi des conditions d’hypoxie. Dans le contexte des glioblastomes l’hypoxie représenterait un facteur très important qui accroît la croissance de la tumeur. Il est donc important de s’intéresser à une éventuelle différence de production d’exosomes par des cellules cancéreuses qui seraient soumises à un stress hypoxique impor-tant comparé à des cellules en condition de normoxie.