Processus MALDI

La technique MALDI repose sur le principe de la désorption/ionisation laser (de

longueur d’onde généralement dans l’UV, de 180 à 450 nm). Ces photons (i) viennent frapper

sous forme condensée l’échantillon qui est un dépôt solidifié constitué de cristaux de matrice

qui entourent les molécules d’analyte (co-cristallisation) et (ii) entrainent la vaporisation et

l’ionisation de molécules présentes dans le dépôt notamment par des processus de protons. La

Fig. 4-1 présente le principe MALDI.

Fig. 4-1 : Principe général du processus d’ionisation assisté par matrice

(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization [MALDI]).

La matrice permet de minimiser la dégradation de l'échantillon provoquée par

l'absorption de l'énergie du faisceau laser incident. L'énergie transmise par le laser est

absorbée par la matrice, et cet apport d’énergie provoque son expansion en phase gazeuse en

entraînant les molécules du composé d’intérêt. Ce phénomène ne mène à un processus

PORTE - ECHANTILLON

Faisceau

laser ^{Molécule cible} _{Cristal de matrice}

Ejection de matière

Transfert de proton(s)

+

d’ionisation que sous certaines conditions d’irradiance du laser incident, définies en tant que

« fenêtre MALDI » comme décrit à la Fig. 4-2.

Fig. 4-2 : Illustration de la courbe d'ablation et de la "fenêtre MALDI"

en fonction de l'énergie du laser incident.

Si l’on se place dans cette gamme d’irradiance laser favorable à la fenêtre MALDI,

l'échantillon étudié sera ionisé majoritairement par transfert de protons, soit avant désorption

dans la phase solide, soit par collision après désorption avec la matrice excitée ou avec

d'autres molécules pour former des ions mono- ou plus rarement multichargés de type

[M+nH]

ⁿ⁺

. Les ions monochargés [M+H]

⁺

ou [M-H]

^-

sont majoritaires dans la plupart des

spectres MALDI. L’origine des protons a été étudiée : les protons labiles (des groupes

carboxyliques ou hydroxyliques) de la matrice, voire de l’échantillon lui-même, ainsi que les

protons non labiles de la matrice semblent être impliqués [184]. Le processus d’ionisation

peut se scinder en 4 étapes successives :

• focalisation du faisceau laser sur la cible (tir+ impact) ;

• désorption du mélange {analyte+matrice} : transfert de l’état condensé à l’état

gazeux ;

• expansion du nuage éjecté dans la source et ionisation des neutres ;

La « qualité » du transfert de ces protons conditionne l’effet MALDI. Si celui-ci

s’accompagne de la libération d’une importante quantité d’énergie (différence d’affinités

protoniques importante entre l’échantillon et la matrice), la fixation d’un proton sur une

molécule d’analyte va apporter suffisamment d’énergie pour que des fragments soient

observés. En revanche, si la différence des affinités protoniques entre échantillon et matrice

est trop faible, l’ionisation de l’analyte ne sera pas de bonne qualité. Ainsi, la différence

d’affinité protonique entre l’analyte et la matrice est un paramètre clé à considérer lors d’une

analyse MALDI. Il convient donc de choisir la matrice adaptée à l’échantillon que l’on

souhaite analyser, selon les critères suivants :

• une masse moléculaire faible afin que ses adduits et/ou ses fragmentations soient les

plus faibles possibles ;

• favoriser la séparation et une distribution homogène des molécules d’analyte afin de

réduire les interactions intermoléculaires entre elles ; en entourant les molécules de

l’échantillon, la matrice préserve celles-ci (i) d’une dégradation photochimique lors

des impulsions laser (tout en étant inerte chimiquement vis-à-vis du composé étudié)

et (ii) d’une dégradation thermique grâce à des interactions spécifiques (ex : liaisons

hydrogènes) ;

• une compatibilité entre le milieu de solvatation et celui de l’échantillon pour un bon

transfert d’énergie et pour une co-cristallisation homogène et complète ;

• une absorption préférentielle de la source laser d’ionisation constituant ainsi un centre

de transfert d’énergie entre le rayonnement laser et le composé analysé ; elle favorise

l’ionisation en induisant notamment des transferts de protons de la matrice vers

l’échantillon ;

• une faible enthalpie de sublimation avec, toutefois, une vitesse d’ablation relativement

importante, afin de créer un jet supersonique permettant la co-désorption des

molécules cibles.

À la vue de tous ces critères, il est évident qu’une matrice universelle n’est pas

envisageable et, à titre d’exemple, le Tableau 4-1 donne une liste de matrices les plus

utilisées. Ce tableau regroupe les abréviations, noms, structures, affinités protoniques et

applications potentielles de ces différentes matrices (liste non-exhaustive).

Tableau 4-1 : Principales matrices utilisées couramment en spectrométrie de masse MALDI [185,186]

Après avoir choisi une matrice spécifique pour un échantillon à analyser, il convient

de sélectionner le meilleur type de dépôt. En effet, chacun des modes de dépôt entraine une

cristallisation différente et, de fait, une réponse MALDI différente. Les trois modes de dépôts

les plus fréquemment employés peuvent être résumés comme suit :

• La goutte sèche (dried droplet) appelée encore dépôt en mélange intime est la

méthode la plus fréquemment employée. La matrice et l’échantillon sont mélangés le

plus souvent à volume équivalent. Cependant, la matrice et l’échantillon doivent être

préférentiellement solubles dans des solvants identiques afin d’éviter la migration de

l’échantillon lors du séchage, ce qui entraînerait l’hétérogénéité du dépôt.

• La couche mince (thin layer) se fait en deux étapes. La matrice et l’échantillon sont

déposés indépendamment au même endroit après cristallisation de la première couche.

Deux variantes sont exploitées : soit l’échantillon est recouvert de la matrice après

évaporation du solvant, soit l’échantillon est déposé sur la fine pellicule de matrice

cristallisée. Le recours à ce mode de dépôt se fait dans le cas où les milieux de

solvatation de la matrice et de l’échantillon ne sont pas miscibles.

Abréviation Nom(s) Structure Affinité  protonique (Kcal.mol‐1) Longueur  d’onde   optimale Applications HABA Acide 2‐(4‐ hydroxyphenylazo)‐ benzoïque 183±2 337/355 Peptides, protéines,  glycoprotéines, polymères  synthétiques, glycolipides  perméthylés FA Acide 4‐hydroxy‐3‐ méthoxycinnamique, ou  acide férulique 183±2 337 Protéines, peptides α‐CHCA α‐cyano‐4‐ hydroxycinnamique 183±2 337 Peptides, protéines,  lipides, oligonucléotides,  PSD 2,5‐DHB Acide 2,5‐ dihydroxybenzoïque, ou  acide gentisique 202,9 337 Peptides, protéines,  lipides, glycoprotéines, oligosaccharides SA Acide 3,5‐diméthoxy‐4‐ hydroxycinnamique, ou  acide sinapinique 204±4 337 Peptides, protéines,  glycoprotéines NA Acide 3‐ pyridinecarboxylique,  ou acide nicotinique 215±4 266 Oligonucléotides,  glycopeptides

Dithranol 1,8,9-anthracènetriol 211,5±1 337 Oligonucléotides,

protéines, Polymères apolaires

• La méthode dite "sandwich" est une variante de la couche mince. De manière

successive, une couche de matrice est déposée, suivie d’une couche d’échantillon et

enfin d’une couche de matrice. Chaque dépôt est effectué après la cristallisation de la

couche précédente.

Ainsi, le choix du solvant de la matrice organique conditionne le mode de dépôt. En

fait, l’importance du choix du solvant dépasse la considération du mode de dépôt car son

choix conditionne également la cristallisation de l’échantillon.

Par ailleurs, un quatrième facteur influence la qualité du dépôt : il s’agit de la

proportion entre analyte et matrice. Généralement, des rapports analyte/matrice de 1/1 à

1/10000 sont adoptés.

A ce jour, le mécanisme MALDI n’est pas entièrement élucidé. Ainsi, seule

l’expérience permet de déterminer la matrice, le mode de dépôt, le solvant et le rapport

analyte/matrice optimal pour un échantillon donné. Le principe de dépôt est résumé sur la Fig.

4-3.

Fig. 4-3 : Principe de la co-cristallisation échantillon-matrice par

la méthode de la goutte sèche (ou mélange intime).

La Fig. 4-4 présente une illustration de deux types de dépôt idéalement cristallisés,

l’un avec la matrice 2,5-DHB formant des aiguillettes (a) et l’autre avec le dithranol formant

un film mince de cristaux homogènes (b). Les photos ont été prises à l’aide de la caméra CCD

(Fig. 4-5) de suivi disponible sur la source MALDI de l’instrument.

Fig. 4-4 : Cristallisation avec deux types de matrices différentes :

(a) 2,5-DHB et (b) dithranol.

1. MELANGE

2. DEPÔT

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