Chez les procaryotes : Escherichia col

Les bactéries aussi ont un système de réparation par JENH (Weller et al., 2002). Weller et al., ont montré que les bactéries ont un hétérodimère Ku analogue à celui identifié chez les eucaryotes et qu’il est capable de recruter une ADN ligase à l’extrémité de l’ADN et donc de stimuler la légation (Weller et al., 2002). L’E. coli est incapable de réparer les CDB par le système de réparation JENH, car elle est dépourvue des protéines Ku et aussi de l’ADN ligase D qui sont indispensables pour ce type de réparation. En 2009, Chayot et ses collaborateurs ont mis en évidence qu’E. coli est capable de réparer les CDBs de l’ADN même en l’absence de deux systèmes de réparation par RH et JENH, grâce au système de réparation de ligature d’extrémités non homologues alternative (JENH-A) (Figure 6)

(Chayot et al., 2010). Ce système a été aussi mis en évidence chez la levure, les cellules de hamster ou de souris ou in vitro dans les extraits acellulaires ou d’œufs de xénope (Liang & Jasin, 1996, Boulton & Jackson, 1996, Kabotyanski et al., 1998, Göttlich et al., 1998, Feldmann et al., 2000). Une nucléase ou une hélicase initie le JENH-A en générant des extrémités d’ADN simple-brin (Figure 6). Au contraire de JENH où la protéine Ku et la ligase D sont présentes pour protéger les extrémités de l’ADN coupées, le JENH-A repose sur la dégradation des extrémités par le complexe nucléase/hélicase RecBCD (Chayot et al., 2010). L’étape suivante est la recherche de microhomologies de part et d’autre de la cassure, dont l’hybridation permettrait la ligature de l’ADN (Chayot et al., 2010, Rass et al., 2012). Des délétions peuvent être détectées lors de l’initiation de JENH-A, ce qui nous amène à conclure que ce mécanisme de réparation est mutagène et n’est pas conservatif (Rass et al., 2012).

Figure 6: Réparation des cassures double-brin par la ligature d’extrémité non- homologue (JENH) chez les procaryotes (A) et par la ligature d’extrémité non-homologue alternative (JENH-A) chez E. coli (B) (Chayot et al., 2010). Figure reproduite avec la permission de Proceedings of the National Academy of Sciences.

INTRODUCTION I.4. Chimioradiothérapie

La chimioradiothérapie est devenue le traitement le plus utilisé pour traiter de nombreux cancers tel que le cancer pancréatique ou du sein. Des résultats encourageants en clinique ont été observés lors de l’administration concomitante de deux modalités. En effet, il a été démontré que cette modalité de traitement induit une augmentation de la destruction des cellules tumorales. Une amélioration du contrôle locorégional de tumeurs, la préservation de l’organe et une amélioration de la survie des patients ont été constatées (Samant et al., 1999, Peters III et al., 2000, Candelaria et al., 2006, Salama et al., 2007, Boscolo-Rizzo et al., 2011). Ces résultats peuvent être la conséquence des modifications des lésions radio-induites ainsi que de leur réparation ou d’un spectre d’action différent en fonction des phases des cycles cellulaires (Hennequin et al., 2009). Les substances chimiothérapeutiques peuvent transformer une lésion facilement réparable en une lésion irréparable (Dolling et al., 1999). Prenant l’exemple de cisplatine qui est un complexe à base de platine, cette substance est capable de se fixer surtout sur des résidus guanine en formant des ponts intra- ou interbrins. Le cisplatine peut inhiber la réparation d’une CDB radioinduite (Begg, 1990, Yang et al., 1995). Une interaction supra-additive aussi a été démontrée lors de traitement concomitant de l’étoposide qui est un poison de topo- isomérase II-α et les RI surtout au cours du bloc en phase G2 du cycle cellulaire radio- induits (Giocanti N, et al., 2000). Le 5-fluorouracile a la capacité de radiosensibiliser les cellules tumorales en empêchant la réparation des lésions radio-induites, par la diminution du pool de dTTP (Bruso et al., 1990). La gemcitabine est un analogue pyrimidique connu pour sa large activité surtout contre les tumeurs solides et il a radiosensibilisé les cellules tumorales par inhibition de la ribonucléotide réductase (Shewach et al., 1994, Lawrence et al., 1996). Il est reconnu que la phase S du cycle cellulaire est la plus radiorésistante et au contraire la phase G2/M est la plus radiosensible (Sinclair & Morton, 2012). Une augmentation de la létalité cellulaire a été observée lors du traitement concomitant avec des agents cytotoxiques spécifiques de la phase S (la camptothécine et ses dérivés; poisons des topo-isomérases I) et de l’irradiation ionisante (Hennequin, et al., 1994). Le paclitaxel et le docétaxel sont deux substances capables de changer la dynamique des microtubules (Blagosklonny & Fojo, 1999). Ils ont pu bloquer la progression de la mitose à forte dose (Hennequin, 2004) et donc synchroniser le cycle cellulaire dans la phase la plus

radiosensible (Choy et al., 1993, Hennequin, 2004, Pawlik & Keyomarsi, 2004). Au niveau tissulaire, l’irradiation peut augmenter la captation cellulaire des agents cytotoxiques, probablement par augmentation de débit sanguin (5-fluorouracile) (Davis et al., 1995). Aussi, la diminution du volume tumoral après un traitement avec l’une des modalités peut améliorer la vascularisation et donc radiosensibiliser de plus en plus les cellules à cause de la réoxygénation des tissus (Milas et al., 1995, Mason et al., 1999).

Plusieurs études ont donc montré l’efficacité de l’utilisation concomitante avec la chimiothérapie et la radiothérapie dans le traitement de nombreux cancers mais les mécanismes spécifiques responsables des effets synergiques observés restent encore inconnus.

20 OBJECTIFS

Objectifs:

Les cassures double-brin (CDBs) de l’ADN sont considérées comme les lésions radioinduites les plus toxiques. Plusieurs études ont montré l’effet létal de ces lésions en cas de non réparation. L’hyperfocalisation sur ces lésions (CDBs) a peut-être retardé la mise en évidence d’autres lésions radioinduites aussi toxiques et létales que les CDBs, mais qui pourraient être induites avec des fréquences plus élevées.

Le premier objectif de cette thèse est donc de réévaluer la contribution des CDBs et d’autres lésions radioinduites dans la létalité cellulaire en utilisant un simple modèle, soit l’ADN (pGEM-3Zf(-)) irradié en solution avec des doses croissantes de rayonnements γ puis transformé à l’intérieur d’E. coli. La fonctionnalité des plasmides, qui représente la proportion de plasmides qui sont encore capables de se répliquer et d'exprimer le gène de résistance à l'ampicilline, pourra ensuite être évaluée indirectement par une mesure directe de l’efficacité de transformation (l'efficacité de transformation peut être séparé en deux composantes. La première composante, dite « fonction d'entrée», contient les probabilités ρS ρC, ρL et que l'ADN dont les formes topologiques: surenroulée, circulaire ou linéaire, respectivement, traversent la membrane cytoplasmique. Ces probabilités sont supposées ne dépendent que de la conformation de l'ADN, mais pas de la dose de rayonnement. La deuxième composante, dite «fonction de survie», représente la proportion de plasmides qui sont encore capables de se répliquer et d'exprimer le gène de résistance à l'ampicilline) en fonctionéon Sanche de la dose d’irradiation. Cette étude nécessitera l’utilisation de modèles mathématiques pour déterminer la fonctionnalité de l’ADN en fonction de la dose d’irradiation et la comparer avec les rendements des différents dommages tel que les CSBs, CDBs, les dommages aux bases puriques et pyrimidiques et les dommages multiples localisés (LMDS = non-DSB

cluster damage). Ces derniers pourront être révélés sous forme de CDBs par l’utilisation

d’enzymes de réparation tel que Fpg (Formamidopyrimidine [fapy]-DNA glycosylase) et Nth (Endonuclease III).

La chimioradiothérapie concomitante est l’une des modalités les plus utilisées pour le traitement de certains cancers surtout en stade avancé. Cependant, la contribution des mécanismes spécifiques responsables de l'efficacité de cette combinaison n'a pas encore

été déterminée. Le rendement des CDBs a augmenté quand l’ADN a été irradié en présence de cisplatine, qui est un complexe à base de platine. La question qu’on a posée est celle-ci, est-ce que cette augmentation de rendement de CDBs pourra expliquer la létalité cellulaire observée après un traitement combiné: RI et cisplatine?

La réponse à cette question été notre deuxième objectif pour évaluer la contribution des CDBs et d’autres lésions radioinduites dans la létalité cellulaire en utilisant le même modèle, soit l’ADN (pGEM-3Zf(-)), irradié en solution avec des doses croissantes de rayonnements γ puis transformé à l’intérieur d’E. coli. Mais cette fois-ci, l’ADN a été modifié avec du cisplatine (deux adduits de cisplatine par plasmide en moyenne).

Notre troisième objectif a été d’évaluer l’effet direct des RI dans la létalité cellulaire. Nous désirons utiliser les électrons de basse énergie (EBEs) comme un moyen d’irradiation. En effet, l’interaction des EBEs (EBE de 0-20 eV) avec l’ADN peut provoquer des dommages biologiques significatifs, sous forme de cassures simples et double brins, à des énergies en-dessous du seuil d’ionisation de l’ADN, qui est de 8 à 10 eV. Par contre, le rôle joué par les EBEs dans la létalité cellulaire est encore inconnu. C’est donc la première fois qu’on testera le rôle des EBEs dans la perte de fonctionnalité de l’ADN. C’est, pour cette raison, l’un de nos ultimes objectifs.

Des films d'ADN (pGEM-3Zf(-)) seront préparés en utilisant la méthode d’adsorption douce sur un substrat de graphite pyrolytique, en présence de 1,3- diaminopropane (Dap2+) et seront irradiés avec une source d’électrons de 10 eV, dans des conditions d’hypervide pendant des temps variables. En effet, l’uniformité des films joue un rôle important dans la réussite de cette expérience, plus le film est uniforme plus nos électrons intéragissent avec l’ADN et donc plus on aura des plasmides attaqués par ces électrons. Pour cette raison, nous désirons bien irradier notre ADN en présence de Dap2+, afin d’obtenir des films les plus uniformes possible.

RÉSULTATS: PREMIER ARTICLE

Article 1:

The relative contributions of DNA strand breaks, base damage and