disponibles pendant un temps relativement long assure que les parasitoïdes se trouvent en situation de rencontrer des hôtes déjà parasités, et doivent donc « choisir » de les accepter ou non. Une fois les parasitoïdes enlevés, les boîtes sont remises à 25°C. Après deux jours de développement, trois à cinq larves de drosophiles de chaque boîte de Pétri sont disséquées afin de dénombrer les parasitoïdes dans chacune d’elles. Le comportement de superparasitisme de chaque femelle est alors estimé en calculant la moyenne du nombre de parasitoïdes par larve de drosophile parasitée.
III. Procédures expérimentales et origines des souches et lignées de
parasitoïdes
III.1. Conditions d’élevage au laboratoire
Les parasitoïdes sont maintenus au laboratoire sur une lignée standardisée de D. melanogaster non infectée par Wolbachia (population de Ste Foy-lès-Lyon, Rhône, France). La lignée de drosophiles est maintenue en l’absence de parasitoïdes sur milieu contrôlé fabriqué à base de farine de maïs, de levure de bière et d’agar dans des tubes plastiques (2,5 cm de diamètre, 10
cm de hauteur), placés à 21°C (LD 12 :12), à raison d’environ 200 drosophiles par tube. Les parasitoïdes sont élevés en petite masse (3 à 6 femelles fondatrices / tube accompagnées de 2 ou 3 mâles) sur les mêmes types de tubes contenant environ 200 œufs de drosophiles et produisent en moyenne 150 descendants.
L. boulardi est élevée à 25°C. Son temps de génération est alors de trois semaines (LD
12 :12 ; RH = 70%). L. heterotoma est élevée à 21°C (LD 12 :12 ; RH = 70%), sa température optimale de développement (Ris 2004). Son temps de génération dans ce cas est d’un mois. En revanche, au cours des expériences, L. heterotoma a été confrontée à la même température que L. boulardi (25°C). Son temps de génération est alors de trois semaines.
Les femelles de parasitoïdes qui nécessitaient d’être vierges pour certaines expériences ont été obtenues par isolement individuel de la pupe parasite dans des cloches de Durham (hauteur : 4 cm, diamètre : 0,8 cm) un ou deux jours avant leur émergence (avec du miel et en condition humide).
III.2. Origines des Leptopilina boulardi
III.2.1. Lignées de référence
Une lignée de L. boulardi de phénotype S et une lignée de L. boulardi de phénotype NS ont été utilisées au cours du travail de thèse : il s’agit des « lignées de référence » qui sont de même génotype nucléaire (lignées iso-géniques) notées par la suite Sréf et NSréf. La lignée NSréf provient de Sienne (Italie) et a été fondée en 2000. Elle a été obtenue à partir d’une lignée iso-femelle maintenue en croisements frères-sœurs pendant huit générations (Varaldi 2003). Les femelles de cette lignée NSréf ne déposent en moyenne qu’un seul œuf par hôte. La lignée Sréf a été obtenue par transfert horizontal de particules virales lors d’un événement de superparasitisme impliquant une lignée NSréf et une lignée superparasitante originaire de Gotheron (Drôme, France). Les femelles de cette lignée Sréf superparasitent leurs hôtes. Le comportement de ces deux lignées est resté très clairement tranché au cours des nombreuses générations durant lesquelles ont eu lieu les expériences.
Notons que la souche virale des lignées Sréf utilisée par J. Varaldi au cours de sa thèse (2003) était différente de celle précédemment décrite, la lignée ayant été perdue. En effet, J. Varaldi avait alors construit une lignée de phénotype S par transfert artificiel de particules virales d’origine Sienne (Italie) dans la lignée NSréf en utilisant un micro-injecteur (Varaldi et
III.2.2. Populations naturelles du sud-est de la France
Plusieurs populations naturelles de L. boulardi du sud-est de la France ont été échantillonnées pour le besoin des expériences de ce travail de thèse. Les campagnes de terrain ont au total été menées dans 15 stations distribuées le long de la vallée du Rhône, de la périphérie nord de Lyon jusqu’à la côte méditerranéenne. Les pièges consistent en des boîtes plastiques cylindriques fermées suspendues dans des arbres fruitiers ou dans des buissons (Figure I.8) et contenant une banane entaillée. Ce système expérimental simule un fruit standard que les insectes (drosophiles puis parasitoïdes) peuvent coloniser librement durant les 15 jours où ils sont laissés en place avant d’être ramenés au laboratoire pour être analysés. Dans les cas où il n’était pas possible de laisser des pièges durant 15 jours sur le terrain, il a alors été ramassé des fruits, déjà en décomposition avancée, de manière à ce que les parasitoïdes aient pu pondre dans les larves de drosophiles se nourrissant du fruit (une trentaine de fruits récoltés par site d’échantillonnage). Pièges et fruits ont été traités de la même façon une fois ramenés au laboratoire où les femelles L. boulardi émergeantes ont été mises à pondre en lignées iso-femelles dans des tubes contenant environ 200 drosophiles. Les élevages ont été maintenues en chambres climatisées, à 25°C (LD 12 :12 ; RH=70%).
Figure I.8 : Piège fermé et site d’échantillonnage type (Station INRA de Gotheron).
Les populations naturelles utilisées avec leur date d’échantillonnage sont les suivantes : - Chasselay (69) (septembre 2007) ;
- Cailloux sur Fontaine (69) (septembre 2007) ; - St Maurice de Beynost (01) (septembre 2007) ; - Ste Foy-lès-Lyon (69) (septembre 2007) ; - St Laurent d’Agny (69) (septembre 2007) ; - Villette sur Vienne (69) (septembre 2007) ; - Sonnay (38) (septembre 2007) ;
- Epinouze (26) (septembre 2007) ;
- Lens-Lestang (26) (septembre 2004 et 2007) ; - Annonay (07) (octobre 2004 et septembre 2007) ; - Gotheron (26) (octobre 2004, septembre 2006 et 2007) ; - Avignon (84) (octobre 2004 et septembre 2007) ; - Antibes (06) (novembre 2004) ;
- Bras (83) (octobre 2004) ;
- Pierrefeu du Var (83) (octobre 2004).
III.2.3. Autres populations naturelles de L. boulardi
Trois populations naturelles de L. boulardi issues de sites d’échantillonnage hors France métropolitaine ont été également utilisées. Le principe d’échantillonnage a été le même que celui détaillé précédemment : quelques bouteilles ou pots plastiques ont été déposés dans les différentes régions visitées durant plusieurs jours puis récupérés et ramenés au laboratoire. Le nombre de pièges posés n’est pas aussi élevé que précédemment (entre un et cinq pièges environ) et varie selon les sites. Leur provenance, leur date d’échantillonnage ainsi que leur « collecteur » sont les suivants :
- Rio de Janeiro (Brésil) (2007) (J. David); - Martinique (1999) (M. Boulétreau); - Sienne (Italie) (2000) (J. Varaldi); - Sicile (2000) (M. Boulétreau);
- Lamto (Côte d’Ivoire) (1996) (Y. Carton);
- Palma de Majorque (Espagne) (2006) (S. Gandon).
III.3. Lignée de L. heterotoma
Une seule lignée de L. heterotoma a été utilisée au cours de ce travail de thèse. Il s’agit d’une lignée homozygote, obtenue par des croisements frères-sœurs répétés pendant 35 générations
et provenant d’Antibes (souche A7, Alpes-Maritime, France ; sympatrique avec L. boulardi). Deux souches (correspondant à des sous-lignées) ont été utilisées. L’une est tri-infectée par
Wolbachia (wLhet 1, wLhet 2 et wLhet 3), ce statut d’infection étant celui le plus
fréquemment rencontré dans les populations naturelles (Vavre et al. 1999 ; Vautrin 2008). La seconde souche est issue de la première. Des traitements antibiotiques réalisés sur la souche A7 tri-infectée ont permis d’obtenir une souche non infectée par Wolbachia (Mouton et al. 2003).