Mise au point d’un outil moléculaire de détection de l’infection virale

En analysant la banque soustraite obtenue par Evrogen, nous avons noté que dix des séquences obtenues ne trouvaient aucune similarité dans les banques alors que leur expression apparaissait spécifique des lignées S_réf, comme c’est par exemple le cas pour les clones

entourés de rouge dans la figure II.4. (p.36). Nous avons dessiné des amorces à partir de ces dix séquences et testé par PCR différents extraits d’ADNc de parasitoïdes femelles issues de lignées Sréf et NSréf. Sur les dix couples d’amorces testés, sept ont révélé une amplification identique pour les deux types d’échantillons d’ADNc (Sréf et NSréf) ; il s’agissait donc de séquences « faux positifs ». En revanche, les trois autres couples d’amorces ont montré une amplification spécifique pour les échantillons d’ADNc d’individus de phénotype S (Figure II.5).

Nous avons alors réalisé une PCR avec les trois couples d’amorces précédents sur des échantillons d’ADN génomique. Trois résultats possibles pouvaient alors être envisagés : (1) sous l’hypothèse d’un gène de l’insecte spécifiquement exprimé en présence du virus, on s’attendait à observer une amplification dans les échantillons d’ADN Sréf et NSréf ; (2) sous l’hypothèse d’un virus à ADN (ou d’un virus ARN présentant une phase ADN durant son cycle de réplication), on s’attendait à observer une amplification seulement pour les échantillons d’ADN Sréf ; (3) sous l’hypothèse d’un virus à ARN, on s’attendait à n’observer aucune amplification dans les deux statuts d’infection.

Pour l’un des trois couples d’amorces (couple d’amorces 3), nous avons observé une amplification spécifique à partir des échantillons S_réf et non des NS_réf (Figure II.5). Cette amplification d’ADN, qui se produit uniquement chez les femelles parasitoïdes présentant le comportement de superparasitisme, suggérait que la séquence détectée était d’origine virale. Pour les deux autres couples d’amorces (couples d’amorces 1 et 2), aucune amplification n’a été détectée ni dans les échantillons S_réf, ni dans les échantillons NS_réf d’ADN génomique (Figure II.5). Bien que l’étude de ces amorces n’ait pas été plus développée, on peut supposer que les conditions PCR n’étaient pas au point et que la quantité d’ADN amplifiée fut trop faible pour permettre de visualiser un signal. On ne peut pas non plus rejeter, au vu des hypothèses précédentes, le postulat de l’existence d’un second virus à ARN infectant spécifiquement les individus superparasitants.

NS S NS S NS S NS S NS S NS S NS S NS S NS S NS S +

-ADN ADNc

Couple d’amorces 3

Couple d’amorces 1

ADN ADNc ADN ADNc

+ - ⁺ -Couple d’amorces 2 NS S NS S NS S NS S NS S NS S NS S NS S NS S NS S + -ADN ADNc Couple d’amorces 3 Couple d’amorces 1

ADN ADNc ADN ADNc

+ - ⁺

-Couple d’amorces 2

Figure II.5 : Test de trois couples d’amorces PCR sur des échantillons d’ADNc et d’ADN

génomique de femelles L. boulardi superparasitantes (S) et non superparasitantes (NS). ADN : ADN génomique ; ADNc : ADN complémentaire.

Couple d’amorce 1 : séquence du clone I1-28 ; couple d’amorce 2 : séquence du clone I1-82 ; couple d’amorce 3 : séquence du clone I1-CL1.

S : superparasitant ; NS : non superparasitant.

En résumé, une seule des séquences testées s’est révélée être totalement spécifique des ADN génomique et ADNc des lignées S_réf. Ces expériences nous indiquent qu’à au moins un moment de son cycle de réplication, l’acide nucléique viral se trouve être sous forme ADN.

Après une phase de mise au point, nous avons, sur la base de cette séquence, défini un test diagnostique PCR de l’infection par LbFV à l’échelle individuelle (PCR multiplex). L’étape suivante a consisté à démontrer la fiabilité de cet outil dans le diagnostic de l’infection par LbFV. La corrélation entre amplification par PCR et comportement de superparasitisme a été testée par deux types d’expériences.

(1) L’association amplification PCR/superparasitisme a été testée en réalisant des tests PCR sur des lignées de L. boulardi de différents génotypes dont le phénotype S ou NS était connu. En parallèle de quelques uns de ces tests moléculaires ont été menés des tests comportementaux. Les individus testés étaient issus des lignées de référence de laboratoire (Sréf et NSréf) ainsi que de souches issues de populations naturelles. L’association s’est révélée parfaite : aucune amplification par PCR pour les échantillons des souches de phénotype NS contrairement aux échantillons des souches de phénotype S où une amplification par PCR est

visible (n=93). Cependant, au sein de la lignée infectée S_réf, une minorité de femelles (7/36 femelles testées) n’expriment pas le comportement de superparasitisme bien qu’elles aient été diagnostiquées comme étant infectées par test moléculaire, traduisant une pénétrance incomplète du virus. Le virus ne manipule donc pas toujours le comportement de son hôte, ce qui peut être la conséquence d’une trop faible densité en particules virales. Ce résultat renforce l’intérêt de la mise au point de l’outil PCR pour une détection plus fiable de l’infection.

(2) L’association amplification PCR/superparasitisme a aussi été testée par le biais de la transmission horizontale des particules virales d’un hôte de phénotype S à un hôte de phénotype NS lors d’un événement de superparasitisme. Le principe consistait à transformer une lignée de phénotype NS en une lignée de phénotype S et à montrer qu’avant transfert horizontal du virus, les guêpes présentaient le phénotype NS mais aucune amplification PCR alors qu’après transfert, les lignées devenaient de phénotype S et présentaient un signal par PCR. La corrélation amplification PCR/superparasitisme s’est révélée parfaite (n=56). La réussite des expériences de transferts horizontaux (Th ≈ 70%) et le maintien pendant de nombreuses générations de l’infection dans les lignées nouvellement infectées confirment une transmission horizontale et verticale très efficace.