Procédure de mise en place de la fenêtre crânienne

Une fenêtre crânienne est un outil d’accès optique au cortex cérébral par le crane pour l’imagerie in vivo.

Le choix du modèle de fenêtre crânienne retenu a été un point important dans la mise en place de cette étude, puisqu’en effet, il existe différents types de fenêtres crâniennes (Drew et

al., 2010; Xu et al., 2007) :

- Le modèle de fenêtre ouverte : l’os du crâne ainsi que la dure-mère sont retirés sur une petite portion d’environ 2 mm2 _{(Sadakane et al., 2015).}

- Le modèle de fenêtre ouverte avec maintien de la dure-mère : là encore, l’os est retiré sur une petite portion de crâne 2 mm2_{, mais la dure-mère est laissée en place (Stetter et}

al., 2013).

- Le modèle de fenêtre par affinage du crâne : sur une portion de crâne similaire en termes de taille, l’os est affiné jusqu’à obtenir une fine membrane transparente d’environ 15- 25 µm d’épaisseur (Yang et al., 2010).

- Le modèle de fenêtre par affinage du crâne renforcé : le principe est le même que le modèle décrit précédemment, à la différence qu’une lamelle de verre est collée à la surface de l’os affiné, de façon à le renforcer (Drew et al., 2010).

Dans notre étude, nous avons choisi de travailler chez la souris notamment vis-à-vis du type de fenêtre crânienne associé.

En effet, le premier modèle de fenêtre que nous venons d’évoquer est adapté à des animaux dont la dure-mère est trop épaisse pour réaliser une imagerie intravitale au travers de celle-ci, comme par exemple pour le rat et le marmouset (petit primate non-humain). L’os et la dure- mère étant retirés, la pression intracrânienne et donc l’homéostasie cérébrale est perturbée, c’est

139

en effet le gros point faible de ce modèle. D’autre part, la suppression du crâne et de la dure- mère laisse une partie du cerveau vulnérable durant la mise en place de la lamelle de verre.

Le second modèle est adapté à la souris, dont la dure-mère est suffisamment fine pour ne pas trop altérer l’imagerie in vivo. L’intérêt de ce modèle est de pouvoir utiliser certains marqueurs nécessitant une application corticale, comme pour le SR101 un marqueur astrocytaire, ou encore le Fluo4-AM (Fluo4-acetoxyméthyl) qui marque le calcium astrocytaire. Dans ce modèle, la dure-mère est laissée intact et permet donc de limiter l’altération de la pression intracrânienne, elle ne l’empêche toutefois pas complètement puisque l’os est retiré.

Le troisième modèle est également utilisable chez la souris dès l’instant que l’os est suffisamment affiné pour limiter la dispersion du signal de fluorescence et ainsi permettre une imagerie en profondeur. Toutefois, le crâne étant très aminci, il devient aussi très fragile et est susceptible d’être rapidement lésé, mettant alors en danger l’intégrité du cortex cérébral.

Dans notre étude, nous avons tiré parti de l’existence de la souche de souris transgénique CX3CR1 pour laquelle les cellules microgliales possèdent un signal de fluorescence intrinsèque. N’ayant donc pas la nécessité d’ajouter des marqueurs diffusibles directement à la surface du cortex, nous nous somme dirigés vers un modèle de fenêtre fermé par affinage du crâne. L’os et la dure-mère étant laissés en place, le milieu très peu perturbé est propice à l’analyse du système immunitaire très sensible à toute variation et stimulation non- physiologique. Après avoir tenté la mise en place de la fenêtre sans la protection d’une lame en verre, nous nous sommes finalement orientés vers le dernier modèle cité, qui nous permet de garantir l’intégrité cérébrale une fois la fenêtre réalisée.

La fenêtre crânienne est mise en place sur les animaux contrôles et les animaux hypertendus 2K1C et AngII (Figure 42). Dix minutes avant le début de la chirurgie, les souris reçoivent de la Tolfédine (0,1 ml/kg) injectée en i.p. L’induction de l’anesthésie est réalisée par inhalation

140

d’isoflurane à 5 % (ajouté à 30 % d’oxygène et de 70 % de protoxyde d’azote) pendant 2 minutes. La quantité d’isoflurane est ensuite diminuée à 2 %. La vitamine A est appliquée sur les yeux des animaux et la sonde rectale couplée au tapis chauffant est mise en place. Les animaux sont positionnés dans un cadre orientable qui permet de stabiliser parfaitement leur tête. La peau de la tête est nettoyée et désinfectée à l’alcool et à la Bétadine. Une petite portion du scalp de 6 mm2 est retirée et étirée, de façon à exposer le crâne au-dessus du cortex somatosensoriel. A ce niveau, l’os est minutieusement fraisé pendant environ 30 minutes sur une zone de 4 mm2. Toutes les 30 secondes, un coton-tige imbibé d’eau physiologique est passé délicatement sur cette région, afin de limiter l’échauffement du tissu cérébral causé par le fraisage. Ainsi, le crâne est aminci jusqu’à devenir complètement transparent (épaisseur mesurée d’environ 50 µm). Le fraisage doit être délicat, sans à-coup et homogène, de façon à produire une surface plane, sans aspérité qui pourrait altérer l’imagerie. Une lamelle de verre de 2 mm2 est découpée à l’aide d’une pointe diamant. Elle est ensuite fixée au niveau de la région amincie par de la glue cyanoacrylate (Loctite #414, SEFI, Caen). Cette étape doit être réalisée avec beaucoup de minutie pour éviter l’apparition d’une bulle sous la fenêtre qui empêcherait l’imagerie. Puis, le scalp est collé au niveau des bords de la fenêtre et une piscine est réalisée par du ciment dentaire. Les bords de la piscine doivent être réguliers et suffisamment hauts pour empêcher la fuite de l’eau pendant l’imagerie, mais suffisamment bas pour permettre la descente de l’objectif à immersion utilisé. Enfin, la zone est recouverte de Xylocaïne 5 % avant de remettre l’animal dans sa cage. L’imagerie n’est faite qu’à partir du lendemain de la pose de la fenêtre, afin de laisser les animaux récupérer de la chirurgie.

141

Figure 42. Modèle de fenêtre crânienne pour l’imagerie in vivo. A. Schéma représentatif du

modèle de fenêtre crânienne utilisé dans cette étude : le modèle d’os affiné renforcé, initialement décrit par Drew en 2010 (Drew et al., 2010) B. Vue prise du dessus de la fenêtre une fois la lamelle collée. L’absence de saignement et l’aspect des vaisseaux sont contrôlés pour valider la qualité de la fenêtre. Barre d’échelle : 1 mm.

Il faut savoir que la mise au point d’un tel modèle est très complexe et demande de très nombreuses heures d’apprentissage pour pouvoir garantir les conditions physiologiques du tissu cérébral. Une fenêtre crânienne qui n’est pas parfaitement réalisée génère automatiquement des données erronées, d’autant plus que dans notre étude, nous nous sommes intéressés à l’inflammation cérébrale. En conséquence, une fenêtre présentant au moins l’une des caractéristiques suivantes était exclue du protocole (Figure 43).

- Des micro-saignements corticaux ou de la dure-mère - Des altérations morphologiques des vaisseaux

Lamelle de verre Vaisseau piemérien Cortex cérébral Glue Cortex cérébral

A

B

142

- Des zones de réactivité microgliale (hypersignal GFP) - Des microfissures du crâne

- La présence de bulles d’air sous la fenêtre empêchant l’imagerie

- Une épaisseur d’os trop importante, limitant le signal de fluorescence et donc l’imagerie en profondeur

Figure 43. Points de contrôle pour la validation de l’état de fenêtre crânienne. Images

prises 1 jour après l’installation de la fenêtre chez des souris transgéniques CX3CR1GFP/+_.

L’autofluorescence du tissu cérébral permet d’observer les vaisseaux par contraste. Les micro- points lumineux verts correspondent aux cellules microgliales. A. Cortex intact. B. Cette fenêtre présente des saignements à la surface du cortex (zones entourées en pointillés blancs). C. Les vaisseaux sont dilatés et sinueux (flèches blanches). Le marquage microglial intense (pointillés blancs) témoigne d’une inflammation localisée. Barre d’échelle : 200 m.

Un gros travail a également été réalisé pour optimiser le système de fixation de l’animal. La parfaite stabilisation de la tête de l’animal est un aspect essentiel pour l’imagerie à l’échelle cellulaire. En effet le moindre mouvement micrométrique rend l’imagerie impossible. Le modèle initial développé au laboratoire chez le rat, nécessitait la mise en place de plusieurs boulons à la surface du crâne. Ce système relativement encombrant pour l’animal a été amélioré. Ici, seule la portion de scalp au niveau de la fenêtre est retirée et le système est limité à la fenêtre en elle-même. D’autre part, l’expertise acquise pour la réalisation de la fenêtre crânienne, ainsi que pour l’imagerie biphotonique in vivo nous a permis de collaborer pour la publication d’une étude parue en 2018 dans Theranostics (Falzone et al., 2018)(voir Annexe 2).

143