Problématiques et objectifs de la thèse

Les nombreuses expériences biochimiques, biophysiques et structurales ont considérablement

amélioré notre compréhension des mécanismes moléculaires de la dégradation des protéines au

cours des dernières décennies.

Les expériences à l’échelle de la molécule unique sur le système ClpXP ont mis en lumière les

relations entre le dépliement et le transfert de substrats protéiques de façon corrélée à l'hydrolyse

de l'ATP (voir partie 5.2.4). Les études structurales par cryo-microscopie électronique sur les

protéasomes ont quant à elles révélé des modèles de liaison à l'ATP et des changements

conformationnels concomitants (voir partie 5.2.3). Ces études ont fourni de nouvelles informations

sur la corrélation entre l'hydrolyse ATP, les changements conformationnels coordonnés des

sous-unités des particules régulatrices AAA+, et l'interaction et la progression du substrat de la particule

régulatrice vers la particule catalytique. Très récemment, des structures de résolution atomique du

protéasome 26S de la levure et humain avec un substrat engagé ont été obtenues. Bien que ces

études aient permis de rapides et considérables progrès dans nos connaissances des protéases

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AAA+, on ne possède que peu de données structurales en solution sur le protéasome et ses

substrats. En particulier, des informations structurales directes sur les substrats, leurs états dépliés

putatifs, les produits de dégradation, ainsi que l'évolution de leurs populations respectives au cours

du temps pendant le processus de dégradation, demeurent rares à ce jour40. Dans ce contexte le

protéasome PAN-20S des archées hyperthermophile est un objet d’étude de choix.

Cette thèse a pour objectif principal d’apporter des informations sur le mode d’action du

protéasome PAN-20S de M. jannaschii, et en particulier sur le processus de dépliement

des substrats protéiques. Ce système présente tous les avantages des protéines provenant

d’organismes hyperthermophiles (voir partie 2.3.2), mis à profit pour les études biophysiques par

diffusion de neutrons aux petits angles résolue en temps (TR-SANS, de l’anglais « Time-Resolved

Small Angle Neutron Scattering »). Un substrat modèle a été utilisé lors de ces études. Il s’agit de la

protéine fluorescente verte (GFP, de l’anglais « Green Fluorescent Protein ») modifiée par une étiquette

d’adressage ssrA à l’extrémité C-terminale (GFPssrA). L’étude des changements conformationnels

de la GFPssrA pendant le processus de dépliement et de dégradation par le système protéolytique

PAN-20S était l’objectif principal de cette thèse. Le processus de dépliement et de dégradation

de la GFPssrA par le protéasome PAN-20S a été suivi en temps réel par des mesures

biochimiques et par une approche biophysique novatrice, le TR-SANS.

Le SANS permet d’étudier les structures et les changements de conformation des protéines solubles

et des complexes qu'elles forment325,326. Contrairement au SAXS, technique plus courante et plus

répandue, le SANS est capable de distinguer différentes protéines au moyen de leur deutération

sélective327 et de la variation du contraste des solvants (échange H2O/D2O)328–330. En particulier, les

protéines naturelles (c'est-à-dire hydrogénées) peuvent être rendues « invisibles » à environ 42 %

de D2O et le signal SANS peut être attribué presque exclusivement aux protéines deutérées37.

Compte-tenu de la complexité du système étudié en termes de taille et de sa grande flexibilité en

solution, le SANS, combinée avec la deutération et la variation de contraste, est une des rares

techniques capables de fournir des données structurales en solution en distinguant les différents

partenaires. En se basant sur le principe de la variation de contraste (voir chapitre 2, partie 3.5), la

GFPssrA utilisée lors des mesures SANS a été deutérée, tandis que les complexes PAN et 20S

étaient hydrogénés. Le tampon contenait quant à lui 42% D2O et 58% H2O (figure 39). Ainsi, le

signal du système protéolytique étant masqué, la courbe de diffusion enregistrée correspond

uniquement au signal de la protéine GFPssrA deutérée.

Au cours des vingt dernières années, le SAXS a subi une importante évolution au niveau du

développement instrumental et des applications aux systèmes biologiques331,332. Cependant, le

SANS étant moins utilisé que le SAXS, beaucoup moins de développements ont été réalisés au

niveau des instruments dédiés aux applications biologiques. Ce projet de thèse qui couple la

spectroscopie de fluorescence en ligne et le suivi en temps réel d’une réaction biologique

présente donc un fort un intérêt méthodologique. Il s’agit du développement du projet

précédent concrétisé par la thèse de Ziad Ibrahim.

Le court temps d’exposition de 30 secondes utilisé pour la collecte des données de chaque courbe

SANS mesurée a permis de suivre la cinétique de dépliement et de dégradation de façon résolue en

temps pendant les 45 minutes de réaction. Ce temps d’exposition est particulièrement intéressant

lors des 10 premières minutes de réaction où l’essentiel de la réaction a lieu. Les données recueillies

pendant cette période recèleront donc beaucoup d’informations. De plus, la mesure de la

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fluorescence de la GFPssrA, couplée à la collecte des courbes SANS, a fourni des informations

supplémentaires sur le processus en faisant la connexion entre le dépliement de la GFPssrA du

point de vue structural et la perte de sa fluorescence due à la déstabilisation du chromophore. Il

faut également souligner que l’utilisation d’un système d’archée hyperthermophile comme

modèle d’étude fournit un avantage essentiel en permettant la thermoactivation du

système PAN-20S, contrôlant ainsi la cinétique enzymatique d’hydrolyse de l’ATP et le

processus de dépliement et de dégradation.

Cette approche, combinée avec d’autres techniques biochimiques et structurales utilisées durant

cette thèse (mesures de la consommation d’ATP, spectrométrie de masse, SAXS, microscopie

électronique) a constitué un outil puissant pour réaliser une caractérisation fonctionnelle du

protéasome PAN-20S qui nous a permis de mieux comprendre le mode d’action de cette machine

moléculaire.

En effet, on ne sait toujours pas de façon claire si le protéasome PAN-20S déplie progressivement

ses substrats en libérant des produits partiellement dépliés puis en les dégradant dans une seconde

étape ou bien si le dépliement et la dégradation des substrats est un processus linéaire et concerté

en une seule étape. Une seule machinerie PAN-20S pourrait également utiliser plusieurs

mécanismes alternatifs, comme il a été décrit pour la protéase ClpXP. L’utilisation de techniques

biophysiques en solution et résolues en temps pour suivre les changements conformationnels des

substrats protéiques pendant le processus de dépliement et la dégradation, couplée à des mesures

en temps réel sur l’hydrolyse de l’ATP, pourrait permettre de mieux comprendre le mode d’action

de ces machines moléculaires.

Au cours de cette thèse, les protéines du système ont été produites au laboratoire. Un travail

d’optimisation et de caractérisation approfondie a été réalisé afin de maitriser la qualité de leur

préparation et notamment de contrôler l’état oligomérique de la particule régulatrice PAN (chapitre

5). Des études ont ensuite permis de caractériser l’activité du système GFPssrA, protéasome PAN

-20S afin de définir les conditions (concentrations des composants, température, temps de mesure)

permettant une activité optimale pour les mesures TR-SANS. Des mesures d’hydrolyse de l’ATP

par PAN ont également été réalisées afin de coupler ces informations à celles sur le dépliement et

dégradation de la GFPssrA (chapitre 6). Ce travail de biochimie a été essentiel pour déterminer les

conditions expérimentales optimales pour les mesures TR-SANS et obtenir des résultats

exploitables sans biais expérimentaux. Une fois ce travail effectué, les mesures en TR-SANS ont

alors pu être appliquées au système GFPssrA, protéasome PAN-20S (chapitre 7). Pour compléter

cette étude principale, une seconde stratégie a été développée visant à bloquer la GFPssrA au cours

de son dépliement par PAN. Pour cela, une molécule de streptavidine monovalente a été attachée

à l’extrémité N-terminale ou C-terminale de la GFPssrA dans le but de provoquer un

encombrement stérique317(chapitre 5). L’activité du système GFPssrA-streptavidine, protéasome

PAN-20S dans les conditions d’études nécessaires aux mesures TR-SANS a ensuite été caractérisée

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Dans le document Étude du mécanisme d’action du protéasome PAN-20S par diffusion de neutrons aux petits angles résolue en temps (Page 61-64)