Premiers résultats

Afin de connaître les effets du plasma sur de l’ADN plasmidique, le jet de plasma a été placé en condition « Effleurement » pour un débit de 1 slm et une tension de 4 kV.

La Figure 6-7 représente la migration de l’ADN par électrophorèse pour différents temps de traitement et pour différentes conditions : lorsqu’il n’y a que de l’hélium (Gaz) et lorsque le plasma est allumé (plasma). Le témoin représente le cas où l’ADN n’a pas été traité. Ce dernier révèle que l'ADN est majoritairement composé d’ADN sous forme superenroulée et d’une faible partie sous forme circulaire. En l’absence de plasma, c’est-à-dire lorsque la tension appliquée est nulle, l’hélium n’inflige pas de cassures directes, ou très peu (comparaison du témoin, puits n°1, et la condition à 4 minutes, puits n°4). Par contre lorsque la décharge est allumée, au bout de 1 minute l’ADN est majoritairement sous forme circulaire, manifestant que l’ADN a subit des cassures simples brins tandis qu’une faible proportion de l’ADN est sous forme linéaire indiquant la formation de cassures doubles brins. Plus le temps de traitement est long, plus la proportion d’ADN superenroulé diminue jusqu’à quasiment disparaître au bout de 4 minutes, alors que la proportion d’ADN linéaire augmente. Ces résultats montrent que le plasma génère principalement des cassures simples brins qui peuvent être, en augmentant le temps de traitement, converties en cassures doubles brins.

Comme il a été expliqué dans le paragraphe 6.5, les cassures simples et doubles brins ne sont pas les seuls dommages de base potentiellement formés par le plasma. Certaines bases de l’ADN peuvent avoir été oxydées et d’autres peuvent être manquantes (sites abasiques). Afin de mettre en évidence ou non ces dommages de base, l’ADN a été digéré par trois enzymes différentes : Fpg, NTH et APE1. Le résultat des différentes digestions est exposé Figure 6-8.

Figure 6-7 : Migration sur gel d’agarose des différentes populations d’ADN, pour différents temps de traitement pour une tension de 4 kV et un débit de 1 slm. L’ADN est dilué dans du Tris 1mM, pH 7,7. (pb : paire de base)

On constate que la digestion par Fpg de l’ADN témoin (puits 5) se traduit par une légère augmentation de la forme circulaire et une légère diminution de la forme superenroulée en comparaison avec l’ADN témoin non digéré (puits 1). Cette légère variation de chacune des deux formes est aussi observable après traitement de l’ADN plasmidique par les enzymes Nth (puits 9) et Ape1 (puits 13). Ceci indique que certaines bases de l’ADN plasmidique, même en absence de traitement plasma, sont déjà oxydées en solution. Par contre, il est surprenant que le traitement plasma ne semble pas induire de dommages de bases (oxydations ou sites abasiques) reconnus par ces enzymes. Ces premiers résultats montrent que dans nos conditions expérimentales, le plasma utilisé cause principalement des cassures simples et doubles brins.

L’oxygène singulet, O2(a1Δg) a été mesuré au sein de la post décharge de ce plasma [252] et sa densité s’élève à quelques 1014 cm-3. D’autre part, en utilisant la post décharge d’un réseau de micro-décharges de type MHCD (Micro Hollow Cathode Discharge) Sousa et al [253] ont montré que l’oxygène singulet (SDO) et l’ozone (O3) avaient un fort impact au niveau de l’oxydation des bases et des cassures doubles brins.

Ils ont mesuré respectivement une densité de SDO et de O3 en post décharge de

1017 cm-3 et de 1016 cm-3. De plus, ils ont observé que le SDO oxyde principalement la guanine, alors que l’ozone oxyde sans différentiation les quatre bases. Or dans notre cas, nous sommes dans une configuration différente. La solution est traitée par le plasma et non par l’effluent gazeux résultant de la post-décharge. D’autre part, les densités mises en jeu sont drastiquement différentes. Il y a plus de trois ordres de grandeurs entre la densité de SDO mesurées par Sousa et al par rapport à celle mesurée dans notre cas. Vu cet écart, il est possible de supposer qu’il en est de même pour l’ozone. Cette différence de densité pourrait expliquer pourquoi nous n’observons pas de différence avant et après digestion des enzymes. Les espèces réactives dans notre cas ne produisent ni d'oxydation de bases, ni de sites abasiques détectables.

Figure 6-8 : Migration sur gel d’agarose des différentes populations d’ADN après différents temps de traitement. La tension est de 4 kV et le débit d’hélium de 1 slm. L’ADN est dilué dans du tampon Tris à 1mM pH 7,7. Les échantillons correspondant aux résultats de la Figure 6-7 ont été digéré par différentes enzymes : Fpg, NTH et APE1.

Dans le but de savoir si ces cassures sont directement induites par le plasma ou par des sous produits à longue durée de vie créés par l’interaction du plasma avec la solution tampon, celle-ci est d’abord exposée au plasma, puis l’ADN est ajouté à la solution. Ces résultats sont présentés Figure 6-9 et montrent qu’il n’y a quasiment pas de différence entre le témoin et les différents temps de traitement. L’ADN reste principalement sous forme superenroulée. Ces résultats montrent très clairement que l’interaction du plasma avec la solution tampon ne génère pas de sous produits à longue durée de vie susceptibles de casser l’ADN. Ces cassures de brins sont donc probablement directement produites par un ou plusieurs composants du plasma, même si on ne peut exclure complètement la participation de sous produits à courte durée de vie. Ce résultat est différent de ceux obtenus par Oehmigen et al [254] : ils ont montré que l’évolution du nombre de bactéries viables au cours du temps est très proche lorsqu’ils traitent par plasma la solution en présence des bactéries, et lorsque les bactéries sont ajoutées après traitement du milieu. Ces résultats montrent que le plasma induit des modifications dans le milieu capables d’induire des dommages sur la cible biologique.

Il faut noter que les résultats présentés sur la Figure 6-7, la Figure 6-8 et la Figure 6-9 n’ont pas été obtenus pour une même solution tampon. Mais comme il va l’être expliqué au paragraphe suivant, ceci ne pose pas de problème au niveau de l’interprétation des résultats.