Chapitre 5 : Interaction de deux jets de plasma
6.2 Quelques notions de biologie
6.2.1 L'ADN
L’acide désoxyribonucléique, communément nommé ADN, est une molécule présente dans tous les systèmes vivants à l’exception de certains virus. Elle contient toutes les informations génétiques de l’organisme qui lui permettent de se développer et de vivre. L’ADN est aussi le support de l’hérédité, car il contient toutes les informations nécessaires au développement de l’organisme. Lors de la reproduction et au cours des multiples divisions cellulaires, il est transmis à toutes les cellules filles. Au cours de la vie d’un organisme, l’ADN subit quotidiennement des dommages qui, s’ils ne sont pas correctement réparés, peuvent conduire à des mutations. Si ces mutations sont viables, elles peuvent être responsables de la diversité des individus et de l’évolution des espèces. Elles permettent également à l’organisme de mieux s’adapter à son environnement. Malheureusement, elles sont aussi à l’origine du dérèglement de la cellule ce qui peut conduire au processus tumoral ou à toute autre maladie génétique.
L’ADN est constitué de deux brins complémentaires enroulés selon une structure de doubles hélices, schématisé Figure 6-2. Chaque brin est composé d’un enchaînement de nucléotides dont chacun est composé de trois éléments : un sucre, un groupe phosphate et une base azotée, dont il existe quatre sortes différentes : adénine (A), guanine (G), cytosine (C) et thymine (T) [240]. Au sein de la double hélice, l’adénine s’apparie avec la thymine en formant deux liaisons hydrogènes alors que la guanine s’apparie avec la cytosine en formant trois liaisons hydrogènes.
Comme mentionné précédemment, l’ADN peut subir différents types de dommages. Dans la suite il en sera présenté quatre. L’ADN est endommagé à partir du moment où
sa structure moléculaire est modifiée. Ces modifications peuvent se traduire soit par l’ajout d’un élément (par exemple l’oxydation ou la méthylation d’une base), soit par l’absence d’un élément (par exemple perte de la base azotée), soit par une cassure du brin d’ADN (par exemple cassure simple ou double brin).
La Figure 6-3 résume les quatre dommages étudiés au cours de ce chapitre.
a. La cassure simple brin a lieu lorsqu’une des liaisons phosphates d’un des
deux brins d’ADN est rompue. (Figure 6-3 (a))
b. Si chacun des deux brins d’ADN subit une cassure simple brin et qu'elles sont soit en face l’une de l’autre, comme schématisée Figure 6-3 (b), ou soit quelques paires de bases l’une de l’autre [241], alors il se forme une cassure double
brin.
c. Le site abasique correspond à la perte de la base azotée sans rupture du
squelette sucre phosphate (Figure 6-3 (c))
d. Une base est dite oxydée si un atome d’oxygène ou un composé chimique
dérivant de l’oxygène s’y attache. (Figure 6-3 (d))
6.2.2 Les plasmides
Un plasmide est une molécule d’ADN présente majoritairement dans les bactéries. Tout comme l’ADN chromosomique, il possède la capacité de se répliquer. Par contre il est
Figure 6-3 : Schéma de différents dommages que peut subir l'ADN. (a) Cassure simple brin, (b) cassure double brin, (c) site abasique, (d) oxydation de bases.
non essentiel à la survie de la cellule, mais permet dans certains cas d’apporter des gènes d’intérêt, comme la résistance à un antibiotique [242].
L’intérêt d’étudier de l’ADN plasmidique par rapport à de l’ADN chromosomique est dû à sa plus grande facilité d’obtention et d’analyse. L’ADN plasmidique possède une taille bien inférieure à l’ADN chromosomique. Sa taille varie habituellement de 3 à 400.103 paires de bases, alors que le génome humain par exemple en possède 3.109
stockées dans 23 chromosomes. De plus, l’ADN plasmidique peut être sous trois topologies différentes : Superenroulée (SC), Circulaire (C) et Linéaire (L), comme présenté Figure 6-4. La possibilité d’observer l’ADN sous différentes formes permet de suivre de manière plus détaillée l’évolution des dommages. En effet, si l’ADN superenroulé (forme circulaire fermée) subit une cassure simple brin, il passe sous la forme circulaire du fait de la relaxation des contraintes topologiques. Et si l’ADN superenroulé ou circulaire endure une cassure double brin, il passe sous la forme linéaire. Si d’autres cassures doubles brins apparaissent, alors l’ADN est rompu en plusieurs morceaux, tous sous forme linéaire.
L’ADN plasmidique utilisé dans cette étude est le pcDNA3.1(+) (Life Technologies) qui est composé de 5428 paires de bases. .
6.2.3 Solutions Tampons
Pour étudier l’effet du plasma sur la topologie de l’ADN, celui-ci est dilué à 20 mg/L dans une solution aqueuse tamponnée. Différentes solutions tampons ont été utilisées.
Le tampon Phosphate Salin (PBS) dont la composition en fait un soluté
physiologique. Sa capacité tampon qui est faible repose sur le couple
dihydrogénophosphate (KH2PO4) / hydrogénophosphate (Na2HPO4)
(pKA= 7,2) [243]. Pour cette étude il est utilisé à une concentration de 10 mM (M = mol/L)
Le tampon Tris (Trishydroxyméthylaminométhane) possède un pKa compris
entre 6,5 et 10 [243]. Pour cette étude, différentes concentrations ont été
Figure 6-4 : Schéma des trois formes de l'ADN plasmidique : superenroulée, circulaire et linéaire.
étudiées (10 µM, 100 µM, 1 mM et 10 mM) ainsi que différents pH initiaux (6,6, 7,7 et 8,9). Il faut noter que ce tampon, quoique très utilisé en biologie, a la propriété de relâcher fortement certains ions métalliques.
Le tampon HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique)
est un tampon switterionique c’est-à-dire qu’il est à la fois chargé positivement et négativement dans une gamme de pH donné. Il possède un pKa compris en 6,8 et 8,2 [243]. Durant cette étude, nous avons utilisé une solution à 10 mM avec un pH à 7,5.
6.3 Diagnostics
6.3.1 Electrophorèse
L’électrophorèse est une technique qui permet de séparer par leur masse et leur forme, les différentes structures de l’ADN (superenroulé, circulaire et linéaire). Cette technique consiste à faire migrer l’ADN à travers un tamis moléculaire, tel que le gel d’agarose, situé entre deux électrodes. L’ADN étant chargé négativement, il va migrer du pôle – vers le pôle + selon une certaine vitesse qui dépend de sa structure et de sa taille. Plus les brins d’ADN sont petits, plus ils vont migrer rapidement. Les différentes formes de l’ADN : superenroulé, circulaire et linaire migrent aussi selon une vitesse différente due à leur topologie et aux interactions avec le gel. Comme le montre la Figure 6-4, la forme circulaire migre plus lentement que la forme linéaire, qui elle-même migre plus lentement que la forme superenroulée. L’intensité des bandes indique la concentration relative des différentes populations d’ADN. L’ADN est ensuite révélé après migration en incubant le gel d’agarose quelques minutes dans une solution de bromure d’éthidiuym (BET), qui est un intercalant de l’ADN. Le gel d’agarose est alors placé sur une table émettant du rayonnement UV (entre 312 et 365 nm). A ces longueurs d’onde, le BET intercalé dans l’ADN a la propriété d’émettre une lumière fluorescente. Le BET en solution est 20 fois moins fluorescent que le BET intercalé dans l’ADN.
6.3.2 Enzymes de modification de l’ADN : les glycosylases et AP endonucléase
Si l’électrophorèse en gel d’agarose permet d’identifier rapidement la présence des cassures simples et doubles brins, elle ne permet pas, par contre, de mettre en évidence les sites abasiques et l’oxydation des bases. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser des enzymes de modification de l’ADN. Ces enzymes sont capables de repérer un site modifié spécifique au niveau de la molécule d’ADN, qui peut être par exemple l’oxydation d’une base, d’éliminer la base endommagée et de couper le squelette sucre-phosphate au niveau de la base éliminée, ce qui a pour effet d’introduire une cassure simple brin.
Les enzymes utilisées au cours de cette étude et leur fonction respective sont répertoriées dans le tableau ci-dessous.
Fpg Elimine les bases puriques oxydées (adénine et guanine) et introduit une coupure simple brin.
NTH Elimine les bases pyrimidiques oxydées (cytosine et thymine) et introduit une coupure simple brin.
APE1 Introduit une coupure simple brin au niveau d’un site abasique.
Dans le cadre de notre étude, l’ADN exposé ou non au plasma est alors traité ou non avec les différentes enzymes de modification et les différents échantillons analysés par électrophorèse. La comparaison des résultats avec et sans digestion permet de quantifier le dommage ciblé.
6.4 Dispositif
La géométrie de la décharge est la même que celle présentée au chapitre 2, mis à part au niveau de la longueur de l'électrode de masse, et est schématisée Figure 6-5.
La taille de la décharge est plus longue que celles des décharges étudiées précédemment. L’intérêt est de pouvoir la plonger au sein d’une solution. Lorsque la décharge est immergée dans une solution, il est important d’éviter tout contact entre la solution et l’électrode haute tension. La longueur de cette électrode étant fixée par le fournisseur, le tube diélectrique a été rallongé. D’autre part, afin de guider le plasma jusqu’à la sortie du tube, la taille de l’électrode de masse a été rallongée. De plus un tube en verre a été placé autour du système afin d’isoler l’électrode de masse et d’éviter tout contact avec la solution lorsque la décharge y est plongée.
Figure 6-5 : Schéma de la décharge utilisée pour les investigations biologiques. Les dimensions sont exprimées en millimètre. HT : Haute Tension.
La Figure 6-6 schématise les deux configurations étudiées : lorsque le jet effleure la solution (Effleurement) et lorsque la décharge est plongée au sein de la solution (Immergé). Dans les deux cas, nous n’observons pas de formation de plasma dans le liquide. En configuration immergée, la solution voit l’apparition de bulles à cause de l’arrivée d’hélium. Par contre en configuration effleurement, aucun remous n’est observé à la surface de la solution.