Ajout d’oxygène

Les ROS sont étudiés pour leurs actions thérapeutiques dans divers domaines médicaux [261], comme en cancérologie [62]. Contrairement à d’autres types de plasma [62], [262], [263], celui que nous utilisons ne doit pas générer de ROS en quantités suffisantes ou suffisamment réactives pour endommager l’ADN. Dans le but de connaître l’impact que peuvent avoir les ROS créés par le jet de plasma sur de l’ADN plasmidique, un faible pourcentage d’oxygène est ajouté à la composition du gaz. Cet ajout va avoir comme conséquence de détruire en grande partie les atomes métastables d'hélium.

La Figure 6-15 représente la proportion d’ADN sous ses trois formes selon le débit d’oxygène pour un temps de traitement de 8 minutes lorsque le jet effleure la solution. Pour chaque condition, l’ADN est ensuite traité ou non par la protéine Fpg afin de

0 2 4 6 8 0 20 40 60 80 100 Po ur cen tag e

Temps de traitement (minute)

SC / Effleurement C / Effleurement L / Effleurement SC / Immergé C / Immergé L / Immergé

Figure 6-14 : Pourcentage des différentes populations d’ADN, au cours du temps en configuration immergée et effleurement. L’ADN est dilué dans une solution tampon 10 mM PBS pH 7,2. La tension est de 5 kV et le débit d’hélium de 1 slm. SC= superenroulé ; C= circulaire ; L= linéaire.

révéler la formation de purines oxydées. Les résultats montrent que l’ajout de 0 à 10 sccm d’O2 n’a que très peu d’effet sur le nombre de cassures, et que celles-ci ne sont pas augmentées après incubation avec la protéine Fpg. Ces résultats suggèrent que le plasma ne génère pas d’espèces réactives de l’oxygène capable d’oxyder l’ADN.

D’autre part, on constate que l’ajout de 25 sccm d’O2 a pour effet de réduire le nombre de cassures puisque l’on observe un nombre plus important d’ADN dans la forme superenroulée et circulaire et moins dans la forme linéaire par rapport à une expérience sans ajout d’oxygène. Ceci est probablement dû au fait que dans ce cas le plasma ne touche pas la solution. Comme nous l’avons vu au chapitre 3, l’ajout d’oxygène a comme conséquence de diminuer la longueur de propagation du plasma. Pour 25 sccm d’oxygène, le plasma possède une longueur inférieure à 10 mm, ce qui ne lui permet pas d’interagir avec la solution.

Nous avons également réalisé ces expériences lorsque le jet est immergé dans la solution. Dans ces conditions expérimentales, le comportement du plasma vis-à-vis de l’ADN est radicalement différent lorsque de l’oxygène est ajouté (Figure 1-18).

0 5 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Po ur cen tag e sccm O₂ SC / ss FPG C / ss FPG L / ss FPG SC / av FPG C / av FPG L / av FPG

Figure 6-15 : Pourcentage d'ADN selon ses différentes formes en fonction du débit d'oxygène. Configuration effleurement pour une solution tampon de PBS à 10 mM et pH 7,2. Le temps de traitement est de 8 minutes. Tension appliquée 5 kV et débit de 1 slm d'hélium. A 25 sccm d'O2, le plasma ne touche pas la solution. L : ADN linéaire, C : ADN circulaire, SC : ADN superenoulé.

Contrairement à ce que l’on a décrit pour la situation « effleurement », l’ajout de 25 sccm d’oxygène en immersion augmente fortement le nombre de cassures doubles et simples brins. Dès 1 minutes de traitement (puits n°10 à comparer avec le puits n°4 qui représente la condition sans ajout d’oxygène), l’ADN est fragmenté en de multiples morceaux et plus aucun plasmide d’ADN n’est sous forme superenroulée, ou circulaire et moins de 10% des plasmides restants sont linéaires. De plus à 25 sccm d’oxygène, le plasma ne touche pas la solution, même en immergé. Il reste confiné en amont de la décharge. L’ajout d’oxygène doit probablement augmenter la densité de ROS créés par la décharge, et grâce au remous et au bullage, ces espèces réactives pénètrent de façon plus efficace dans la solution et agissent plus aisément au niveau de l’ADN, lui causant alors plus de dommages.

Ce résultat va à l’encontre du précédent et rend son interprétation peu évidente, car en configuration « effleurement » l’ajout d’oxygène induit peu de différence par rapport à un plasma d’hélium pur, tandis qu’en configuration « immergée » l’ajout d’oxygène augmente drastiquement le nombre de dommages. Le plasma obtenu en configuration « effleurement » et celui en configuration « immergée » ne doivent pas être comparables. Nastuta et al [42] ont montré que l’ajout d’une plaque métallique reliée à la masse modifie la structure du plasma. La solution, selon la configuration, est peut être perçue de manière différente par le plasma, ce qui aurait comme conséquence de modifier fortement son comportement, et ainsi de modifier les espèces créées par le plasma. L’interprétation de ces résultats demande donc plus d’investigations à ce sujet afin de savoir quelle est la cause de ces résultats.

Figure 6-16 : Migration sur gel d’agarose des différentes populations d’ADN pour différents temps de traitement pour un débit de 1000 sccm d’hélium en configuration immergée (puits 2 à 7) et avec 25 sccm d’oxygène (puits 8 à 13). La tension appliquée est de 5 kV. La solution tampon est du PBS à 10 mM.

D’autre part, pour les deux configurations, la digestion par l’enzyme FPG révèle qu’il n’y a pas d’oxydation de bases puriques lorsque de l’oxygène est ajouté. Pourtant l’ajout d’oxygène doit induire une augmentation des ROS, qui sont connues pour leur effet oxydant [261]. Ce résultat peut s’interpréter de la manière suivante : soit l’ajout d’oxygène n’induit pas une augmentation significative des ROS dans la solution, soit les espèces créées n’induisent pas d’oxydation, soit les dommages oxidatifs ne sont pas reconnus par l'enzyme FPG.