A aplicação dos diferentes tipos de stresses descritos na Tabela 2.1., não resultou, de uma forma geral, em alterações significativas da taxa de regeneração (Tabela 2.3.). Nesta tabela apresenta-se a variação na taxa de regeneração (os valores apresentados são a diferença entre a taxa de regeneração inicial e a taxa de regeneração final, após aplicação das condições de stresse aos explantes), nos diferentes meios de indução e, diferentes condições de stresse aplicadas aos explantes.
Com base nesta tabela verifica-se que, os meios utilizados (Br: Meio I3; Er: Meios I5 e I6.1; BG: Meios I2 e I6.1) para a indução de stresse têm valores iniciais de regeneração muito variáveis (entre 3,7% e 60%). É no entanto claro que, no processo de indução, essa variação não se mantêm, ou seja os meios em que há aumento da regeneração, esse aumento é independente do valor inicial de regeneração ser alto, ou baixo (Tabela 2.3.).
Tabela 2.3.: Resultados da indução, para os vários tipos de stresse aplicados, nos meios seleccionados. Os dados foram testados com o programa ACTUS. ***P <0,001; ** P <0,01; *P <0,05; (-) não testado; (morte) o material morreu não se obtendo dados; (MS) meio MS; (SH) meio SH
A regeneração aumentou significativamente, em algumas das condições de stresse (Tabela 2.3.). No entanto, na maioria dos casos, o stresse foi demasiado agressivo para a sobrevivência do explante (comprometendo a possível resposta após
Tipo de stresse Controlo Temperatura acetilsalicílico Nutricional AgNOÁcido 3 CuSO4 pH
Variedades Meio base Regeneração inicial (%) mês/planta (%) 0,69 mg /L (%) 5 g/L (%) 1mg/L (%) 0,1mg/L (%) (%) Brewers
Gold
MS (I2) 10,5 1 6,5 4,39 8,3 27,8* 0,4
SH(I6.1) 3,7 0 2,8 - 4* - 0
Eróica MS (I5) 13 Morte 0 - 4,2 Morte 0
SH(I6.1) 30 3,4 0 0 7,8** 0 0,2
Bragança MS (I3) 60 2 2,1 1,8 3,2 3 0
subcultura para meio fresco), ou o efeito foi pouco efectivo na regeneração, não se verificando um aumento significativo da mesma.
I) Baixa temperatura
Após aplicação de baixas temperaturas, a variedade BG mantida em meio MS forma callus pouco desenvolvidos, densos e de cor verde. Nestes formam-se agregados muito densos que evoluem e, originam novos meristemas, embora o aumento da percentagem de regeneração tenha sido reduzida (1%). Nos meios base SH, os calli apresentaram-se muito friáveis com coloração branca e pouco desenvolvidos. Apesar de os meios utilizados diferirem nas concentrações e suplementações de fitorreguladores, os resultados nestes diferentes meios não são muito evidentes numa fase inicial, após o que (nas subsequentes subculturas em meio fresco), se observam algumas diferenças que se prendem mais com o número de meristemas por explante do que com diferenças na quantidade de explantes com regeneração. Assim, no meio com maior razão citocinina/auxina (meio l7.1, Tabela 2.1.) os resultados são mais evidentes (3,4%; Tabela 2.3.) comparativamente com o meio sem stresse, ou com o meio l6.1 (0,1%, valor não apresentado na Tabela 2.3.), em que essa relação é mais reduzida (Tabela 2.1.).
Na variedade Er, nos meios base MS o stresse pelo frio, provocou clorose acentuada ao longo do tratamento, acabando por provocar a morte dos explantes aquando da sua passagem para meio fresco. Pelo contrário, em meio base SH ocorreu crescimento, originando na subcultura seguinte um aumento da frequência de regeneração de 3,4%, embora esse aumento não fosse estatisticamente significativo. O crescimento ocorreu nas zonas mais medianas do explante (zona central), formando áreas densas e verdes, contrastando com a zona mais periférica do explante que desenvolveu calli muito friável e branco (Fig.2.2. p, q). Em alguns explantes, a zona de crescimento periférica pode atingir 1 a 2 cm de diâmetro, acabando por envolver todo o explante. Este, no entanto, apresenta vitrificação.
Para o Clone Br, o stresse térmico só foi aplicado às culturas em meio base MS visto que, no meio base SH não se verificou indução de organogénese superior a 2-3%. Os resultados obtidos sugerem que o stresse térmico aumenta a taxa de organogénese em 2%, não tendo esta diferença significado estatístico (Tabela 2.3.)
II) Nutricional (deficiência em açúcares)
O stresse nutricional, aplicado às culturas da variedade BG, em meios com 5 g/L de sacarose, induziu o aumento do número de explantes, que formaram rebentos, em cerca de 2,4% (Tabela 2.3.). No entanto, os explantes colocados em meio contendo
apenas água e agar, originaram calli brancos vitrificados, bem desenvolvidos, sem raízes e mantendo verde a zona mediana do explante.
Na presença de 5 g/L de sacarose, os explantes da variedade Er apresentam zonas verdes e zonas vitrificadas, crescimento rápido, sem formação de meristemas. Ocasionalmente, surgem algumas raízes. Nos meios só com água e agar desenvolvem- se raízes, na superfície de calli muito friáveis de coloração branca.
No meio MS com 5 g/L de sacarose, o Clone Br apresenta um reduzido acréscimo da capacidade organogénica, uma vez que a taxa de formação de zonas densas capazes de originar meristemas foi de 1,8% (Tabela 2.3.). No meio desprovido de sacarose, apenas se formaram calli vitrificados, friáveis e não clorofilinos, tal como acontece na variedade BG para a regeneração nas mesmas condições de suplementação de sacarose.
Em nenhum dos ensaios realizados para as variedades Er e BG e para o clone Br as diferenças nos resultados foram estatisticamente significativas.
III) Redução do pH
Os resultados de pH expressos na Tabela 2.3. referem-se ao valor mais elevado de pH, ou seja, no caso do meio MS – 5,6 e no caso do meio SH – 4,9. Visto que, para os valores mais baixos, o meio de cultura ficou excessivamente líquido para poder suportar o explante, levando a condições de anóxia que, se traduziram na morte dos explantes.
A redução do pH do meio, para valores inferiores ao estipulado para os dois meios base testados (SH – pH 4,9; MS – pH 5,6), não alterou significativamente a taxa de regeneração. Aumentando, no entanto, a taxa de oxidação e morte do material vegetal. Assim os resultados para BG, Er e Br não sofreram alteração, mantendo-se a taxa de regeneração, previamente obtida, nos meios originais (sem alteração do pH - Tabela 2.3.) utilizados para as diferentes plantas.