4-2 En présence de CD4 soluble

Comme le montrent les résultats de FRAPrv et de FRET {Gaibelet, 2006 #14}, le CD4 soluble (CD4s) composé des quatre domaines extracellulaires du CD4, a la capacité d’entrer en compétition avec le CD4 membranaire pour l’interaction avec les récepteurs CCR5.

Dans l’objectif de déterminer à quelles populations appartiennent les récepteurs soumis à l’influence du CD4s, des expériences de SPT ont été menées sur la lignée co- exprimant les deux récepteurs. Afin de pouvoir interpréter les données obtenues, l’influence du CD4s sur la lignée n’exprimant que le récepteur CCR5 a aussi été étudiée.

Figure 45 : Répartitions entre les différents modes de diffusion pour les récepteurs CCR5 à l’état basal (60 trajectoires) ou en présence de CD4s (99 trajectoires) Les coefficients de diffusion moyens pour chaque mode de diffusion sont indiqués en échelle logarithmique et exprimés en µm²/s. CCR5 CCR5 + CD4s Log(D1-2) CCR5 Log (D1-2) CCR5 + CD4s 0 20 40 60 80 100

Aléatoire Dirigée Confinée Immobile -6 -4 -2 0 Lo g (D 1-2 ) No m b re de traj ec toires (% ) 0 20 40 60 80 100

Aléatoire Dirigée Confinée Immobile -6 -4 -2 0 Lo g (D 1-2 ) No m b re de traj ec toires (% )

Nous venons de voir qu’en présence du récepteur CD4wt, les proportions de récepteurs confinés et ayant une diffusion dirigée sont modifiées. L’ajout du CD4s réverse en partie cet effet, preuve de la spécificité de l’interaction (Fig. 44).

→ Diffusion aléatoire et dirigée

L’analyse de la figure 44 permet de voir que le CD4s n’a pas le même effet sur les récepteurs ayant une diffusion aléatoire ou dirigée. Au niveau des récepteurs ayant une diffusion dirigée, on observe après incubation avec le CD4s de la lignée co-exprimant les récepteurs CCR5 et CD4wt, des proportions similaires à celles obtenues pour la lignée exprimant seulement le récepteur CCR5.

En ce qui concerne les récepteurs présentant une diffusion aléatoire, la situation est différente. En effet, alors qu’aucune influence sur le comportement diffusionnel de CCR5 lors de la co-expression du CD4wt n’est observée pour ce type de diffusion, l’ajout du CD4s entraîne l’immobilisation de près de 20% des ces récepteurs. Les expériences contrôles menées sur la lignée n’exprimant que le récepteur CCR5, permettent d’observer une diminution similaire de la proportion de récepteurs présentant une diffusion aléatoire en faveur des récepteurs immobilisés (Fig. 45).

De plus, pour ces deux types de diffusion une diminution du coefficient de diffusion est observée après ajout du CD4s. Cependant, pour les trajectoires dirigées, ce ralentissement n’affecte pas les valeurs mesurées pour les vitesses.

Lignée + Condition Rayon des domaines (nm) Coefficient de diffusion (x10-3 µm²/s) CCR5 150 ± 90 4,6 ± 4,8 CCR5 + CD4s 35 ± 30 0,3 ± 0,5 CCR5-CD4wt 110 ± 100 12,0 ± 14,2 CCR5-CD4wt + CD4s 40 ± 30 0,3 ± 0,5

Tableau 8 : Influence du CD4s sur la dynamique des récepteurs confinés des lignées exprimant CCR5 seul ou en présence de CD4wt.

→ Diffusion confinée

L’effet du CD4s sur les récepteurs confinés de la lignée co-exprimant CCR5 et CD4wt est mitigé. Même si la proportion de récepteurs présentant ce type de diffusion est redevenue similaire à celle obtenue pour les récepteurs CCR5 exprimés seuls (Fig. 44), des différences subsistent en particulier au niveau de la taille des domaines et des coefficients de diffusion. L’ajout de CD4s sur la lignée co-exprimant le CD4wt et le CCR5, entraîne une diminution de la taille des domaines dans lesquels diffusent les récepteurs CCR5, accompagnée d’une diminution du coefficient de diffusion (Tableau 8). Or, le même effet est observé sur la lignée n’exprimant que le récepteur CCR5 (Tableau 8). Rappelons, que sur la lignée co-exprimant les deux récepteurs, seul le CCR5 est étiqueté et par conséquent suivi, les résultats rendent donc compte de la dynamique de CCR5, influencée ou pas par les conditions utilisées. Rappelons aussi, que les concentrations de CD4s utilisées sont des concentrations saturantes.

Ainsi, dans ces conditions, il est possible de supposer que l’ajout de CD4s sur la lignée co-exprimant le CCR5 et le CD4wt a deux effets.

D’une part, le CD4s entrerait en compétition avec le CD4wt membranaire dans l’interaction avec le CCR5 (cette dernière se faisait par les parties extracellulaires des deux récepteurs). L’interaction CCR5/CD4wt dissociée par le CD4s, les récepteurs CCR5 seraient dans des conditions similaires aux récepteurs CCR5 exprimés seuls. C’est pour cette raison que les proportions de trajectoires dirigées et confinées après ajout de CD4s sont similaires à celles obtenues pour la lignée n’exprimant que le CCR5 (Fig. 44).

D’autre part, en plus de dissocier l’interaction CD4/CCR5, le CD4s se fixerait sur les récepteurs CCR5 « libres », c’est-à-dire non impliqués dans l’interaction avec le CD4wt. Ce

deuxième effet induirait l’immobilisation d’une partie des récepteurs diffusant de manière aléatoire et au niveau des trajectoires confinées un ralentissement de la diffusion des récepteurs ainsi qu’une diminution du rayon des domaines dans lesquels ils diffusent. Ces deux effets seraient le reflet de l’influence du CD4s observée sur la lignée n’exprimant que le CCR5 (Fig. 44).

Ainsi le CD4s soluble semble avoir une influence sur le comportement diffusionnel du récepteur CCR5, effet visible aussi sur la lignée co-exprimant le CD4wt. Il semblerait aussi que le CD4s ait la capacité de dissocier l’interaction CCR5/CD4wt.

Par ailleurs, la diffusion latérale du récepteur CCR5 est plus influencée par la co- expression du récepteur CD4wt que par l’ajout du CD4s. De plus, même si le CD4s est capable d’entrer en compétition avec le CD4wt dans l’interaction avec le récepteur CCR5, il n’induit pas les mêmes effets. Et enfin, même si l’interaction se fait au niveau des parties extracellulaires, l’organisation dynamique des récepteurs CCR5 est dépendante des parties transmembranaires et/ou cytosoliques des récepteurs.

II-4-3 En présence de gp120

La protéine virale gp120, ne se fixe sur le récepteur CCR5 qu’après interaction avec le récepteur CD4. Deux hypothèses sur le mode d’action de la gp120 existent, supposant que la gp120 augmenterait le nombre de récepteurs en interaction ou bien qu’elle renforcerait les interactions déjà existantes entre CD4 et CCR5. Les résultats obtenus en FRAPrv, comme nous l’avons discuté précédemment, renforcent la seconde hypothèse.

Afin d’essayer d’approfondir les connaissances sur l’action de la protéine virale des expériences de SPT sur la lignée co-exprimant les récepteurs CCR5 et CD4wt ont été réalisées. L’influence de la gp120 sur la diffusion latérale des récepteurs CCR5 exprimés seul a aussi été étudiée.

L’analyse de la répartition des récepteurs entre les différents modes de diffusion avec ou sans gp120 révèle deux différences significatives (Fig. 46). La première au niveau des coefficients de diffusion qui sont systématiquement plus lents en présence de gp120. La deuxième, au niveau des proportions de récepteurs diffusant de façon aléatoire et immobilisés. En effet, comme cela a déjà été observé pour les incubations avec le CD4s, environ 20% de récepteurs présentant une diffusion aléatoire sont immobilisés en présence de la gp120 (Fig. 44 et 45).

CCR5 CCR5+CD4wt CCR5+CD4wt+gp120

Log(D1-2) CCR5 Log (D1-2) CCR5+CD4wt Log (D1-2) CCR5+CD4wt+gp120

Figure 46 : Répartitions entre les différents modes de diffusion pour les récepteurs CCR5 co-exprimés avec le CD4wt en absence (85 trajectoires) ou en présence de gp120 (103 trajectoires). Les coefficients de diffusion moyens pour chaque mode de diffusion sont indiqués en échelle logarithmique et exprimés en µm²/s. 0 20 40 60 80 100

Aléatoire Dirigée Confinée Immobile

-6 -4 -2 0 Log (D 1- 2₎ Nombre de trajec to ir es (% ) 0 20 40 60 80 100

Aléatoire Dirigée Confinée Immobile

-6 -4 -2 0 Log (D 1- 2₎ Nombre de trajec to ir es (% )

Un contrôle réalisé sur la lignée n’exprimant que le récepteur CCR5, révèle l’existence de ces deux mêmes changements (Fig. 47). Or, la gp120 ne peut pas se fixer sur le récepteur CCR5 en l’absence du récepteur CD4 qui induit au niveau de la gp120 les changements conformationnels nécessaires à son interaction avec le récepteur CCR5. Ceci laisse supposer que les deux effets induits par la gp120 sur la lignée co-exprimant les deux récepteurs, à savoir la diminution systématique des coefficients de diffusion et l’immobilisation d’une partie des récepteurs présentant une diffusion aléatoire, ne sont pas spécifiques de l’action de la gp120.

Figure 47 : Répartitions entre les différents modes de diffusion pour les récepteurs CCR5 à l’état basal (60 trajectoires) ou en présence de gp120 (97 trajectoires). Les coefficients de diffusion moyens pour chaque mode de diffusion sont indiqués en échelle logarithmique et exprimés en µm²/s. CCR5 CCR5 + gp120 Log(D1-2) CCR5 Log (D1-2) CCR5+ gp120 0 20 40 60 80 100

Aléatoire Dirigée Confinée Immobile -6 -4 -2 0 Lo g ( D 1-2 ) Nom b re de t ra ject oi re s (% ) 0 20 40 60 80 100

Aléatoire Dirigée Confinée Immobile -6 -4 -2 0 Lo g ( D 1-2 ) Nom b re de t ra ject oi re s (% )

Par ailleurs, l’immobilisation d’une partie des récepteurs ayant une diffusion aléatoire et le ralentissement des coefficients de diffusion sont observés pour toutes les conditions où les cellules ont subi des incubations (CD4s ou gp120) avant la prise des trajectoires. Ces incubations étant réalisées pendant 30 minutes à température ambiante, il est possible de supposer que le stress subi par les cellules est plus important. Ce stress engendrerait une diminution des coefficients de diffusion et par une influence sélective sur les trajectoires aléatoires. Comparées aux trajectoires dirigées et aux trajectoires confinées dont l’existence dépend étroitement de l’organisation membranaire (interactions protéines/protéines, cytosquelette,…), les trajectoires aléatoires sont soumises à moins de contraintes cellulaires. Il peut alors sembler logique, qu’elles soient les plus sensibles aux stress cellulaires. Des contrôles supplémentaires et en particulier l’acquisition de trajectoires sur cellules incubées 30 minutes à température ambiantes dans du milieu de culture, permettront de valider ou d’invalider cette hypothèse.

D’autre part, les résultats obtenus en FRAPrv en présence de gp120 ont montré d’une part, que l’interaction entre les récepteurs CD4 et CCR5 est maximale avant la fixation du virus et d’autre part, que la gp120 rapprocherait les deux récepteurs {Baker, 2007 #319}. Les problèmes soulevés au niveau des expériences de SPT en présence de gp120 rendent difficile l’interprétation des résultats. Cependant, il est intéressant de noter que l’ajout de gp120 à la lignée co-exprimant les récepteurs CCR5 et CD4wt induit une diminution de 0,11 ± 0,09 µm (sans gp120) à 0,03 ± 0,02 µm (avec gp120) du rayon moyen des confinements, sans influence sur la proportion des récepteurs confinés. Le fait que la gp120 n’induise pas une augmentation du nombre de récepteurs confinés mais une diminution de la taille des domaines dans lesquels ils diffusent, laisserait supposer que la liaison de la gp120 n’induirait pas de nouvelles interactions entre les récepteurs mais qu’elle renforcerait, voir resserrerait, les interactions déjà existantes. Si ces données se confirmaient, elles conforteraient les résultats obtenus en FRAPrv.

En conclusion, même si des contrôles sont encore nécessaires, il semble possible de dire que la co-expression du récepteur CD4wt induit des changements au niveau du comportement diffusionnel des récepteurs CCR5. Ces changements se traduisent essentiellement par une proportion moindre de récepteurs présentant une diffusion dirigée alors que la proportion des récepteurs confinés est plus importante. De plus, la spécificité de

l’interaction est montrée par l’effet du CD4s qui est capable d’entrer en compétition avec le CD4 membranaire.