6 Influence de la déstructuration du cytosquelette par la cytochalasine D

L’entrée du VIH dans la cellule cible est au moins en partie dépendante du cytosquelette d’actine {Iyengar, 1998 #217}. Il est donc intéressant d’étudier l’influence du cytosquelette d’actine sur l’organisation membranaire des récepteurs au VIH ainsi que sur l’interaction constitutive CD4/CCR5.

Pour réaliser cette étude, la cytochaline D (Cyto D), spécifique des filements d’actine dont elle bloque la polymérisation, a été utilisée. La mise au point et les conditions d’utilisation de la cytochalasine D, permettant de déstructurer le cytosquelette sont décrites dans le chapitre III et dans le Matériel&Méthodes.

En suivi de particule unique, les diffusions dirigées sont généralement associées à un lien des récepteurs au cytosquelette d’actine. Les lignées exprimant les récepteurs CCR5, sont celles présentants les proportions de récepteurs à diffusion dirigée les plus importantes. Pour cette raison, les premières expériences en présence de Cytochalasine D ont été réalisées sur les lignées exprimant les récepteurs CCR5 seuls ou en présence du récepteur CD4wt.

Dans un premier temps, nous avons regardé l’influence du cytosquelette d’actine sur la lignée n’exprimant que les récepteurs CCR5. L’analyse de la figure 49, montre que la déstructuration du cytosquelette d’actine par la cytochalasine D n’a pas, comme on aurait pu l’attendre, une influence ciblée sur les récepteurs présentant une diffusion dirigée. En effet, la

répartition des récepteurs entre les 4 modes de diffusion est affectée. Ainsi après action de la cytochalasine D, on observe une diminution de la proportion des récepteurs présentant une diffusion aléatoire et dirigée, accompagnée d’une augmentation de la proportion de récepteurs confinés et immobiles. Dans tous les cas, ces changements sont associés à une diminution des coefficients de diffusion moyens.

Nous avons ensuite examiné si l’influence de la cytochalasine D était similaire sur la lignée co-exprimant les récepteurs CCR5 et CD4wt. La répartition entre les différents modes de diffusion montre un effet différent de celui observé sur la lignée n’exprimant que le récepteur CCR5 (Fig 50).

Pour la lignée exprimant les deux récepteurs, la cytochalasine induit une diminution de la proportion de récepteurs CCR5 présentant une diffusion aléatoire associée à une augmentation de la proportion de récepteurs confinés. De plus, la diminution des coefficients de diffusion pour tous les modes de diffusion est aussi observée. Cependant, l’effet sur les proportions de trajectoires dirigée et immobile sur la lignée exprimant les récepteurs CCR5 seuls n’est pas observé sur les lignées co-exprimant les récepteurs CCR5 et CD4wt.

Trop peu de conditions sur l’effet de la déstructuration du cytosquelette d’actine ont été réalisées pour pouvoir conclure sur son mode d’action. Toutefois, il est intéressant de noter que la co-expression du CD4wt diminue le nombre de récepteurs présentant une diffusion dirigée (Fig. 43) et que lors de la co-expression du CD4wt la cytochalasine D n’influence plus la proportion de récepteurs dans ce mode de diffusion (Fig. 49). Il est alors

Figure 49 : Répartition entre les différents modes de diffusion pour les récepteurs CCR5 avant (60 trajectoires) ou après (82 trajectoires) déstructuration du cytosquelette. Les coefficients de diffusion moyens pour chaque mode de diffusion sont indiqués en échelle logarithmique et exprimés en µm²/s. CCR5 CCR5+Cyto D Log(D1-2) CD4 Log (D1-2) CD4+CCR5wt 0 20 40 60 80 100

Aléatoire Dirigée Confinée Immobile -6 -4 -2 0 Lo g( D 1-2 ) No mb re de trajecto ires ( % ) 0 20 40 60 80 100

Aléatoire Dirigée Confinée Immobile -6 -4 -2 0 Lo g( D 1-2 ) No mb re de trajecto ires ( % )

Figure 50 : Répartitions entre les différents modes de diffusion pour les récepteurs CCR5 co-exprimés avec les récepteurs CD4wt avant (85 trajectoires) ou après (108 trajectoires) déstructuration du cytosquelette. Les coefficients de diffusion moyens pour chaque mode de diffusion sont indiqués en échelle logarithmique et exprimés en µm²/s.

CCR5+CD4wt CCR5+CD4wt + Cyto D

Log(D1-2) CCR5+CD4wt Log (D1-2) CCR5+CD4wt + Cyto D

0 20 40 60 80 100

Aléatoire Dirigée Confinée Immobile -6 -4 -2 0 Log (D1 -2) No mbr e de traj ec to ir es ( % ) 0 20 40 60 80 100

Aléatoire Dirigée Confinée Immobile -6 -4 -2 0 Log (D1 -2) No mbr e de traj ec to ir es ( % )

possible d’imaginer que l’interaction entre les récepteurs CCR5 et CD4wt réduirait l’interaction du récepteur CCR5 avec le cytosquelette d’actine, limitant les effets de la cytochalasine D.

La réalisation de conditions supplémentaires, comme l’action de la cytochalasine D sur la diffusion du récepteur CD4 ou bien la déstructuration des microtubules permettront de mieux comprendre l’implication du cytosquelette dans l’organisation latérale des récepteurs CD4 et CCR5.

II-7 Discussion

Les résultats obtenus en SPT, ont permis dans un premier temps de montrer que les récepteurs CD4 et CCR5, exprimés séparément, ont des comportements diffusionnels semblables. Ils se répartissent cependant de façon différente entre les quatre modes de diffusion observés.

En effet, les récepteurs CD4 diffusent majoritairement selon une diffusion aléatoire (~ 67 %) alors que les récepteurs CCR5 se répartissent de façon quasi-équivalente entre une diffusion aléatoire (~ 40 %) et une diffusion dirigée (~ 43 %). Pour les deux lignées, la proportion de récepteurs confinés est peu importante (≤ 15%) et les rayons moyens des domaines sont relativement faibles (~ 130 et 150 nm, respectivement pour CD4 et CCR5).

Au niveau du mode de diffusion confiné une différence, d’environ un facteur 7, entre les coefficients de diffusion des récepteurs CCR5 et CD4 est observée. Compte tenu de la

taille respective des récepteurs (7 et 1 hélices transmembranaires pour CCR5 et CD4) cette différence peut s’expliquer. Mais, contrairement à ce obtenu en FRAPrv, ce rapport n’est pas en accord avec la valeur attendue à partir de la relation entre la taille des récepteurs et le coefficient de diffusion établie par Saffman et Delbrück {Saffman, 1975 #304}. Cependant, les domaines observés en FRAPrv et SPT, vu leur différence de taille, ne sont certainement par les mêmes. Deux hypothèses peuvent être émises. Premièrement, il est possible que CD4 et CCR5 soient dans des environnements membranaires différents qui seraient à l’origine du ralentissement de CCR5. Deuxièmement, au sein des domaines observés, les récepteurs CCR5 pourraient être en interaction avec des protéines d’échafaudage et/ou leurs protéines G présentent dans les HEK293, ce qui pourrait mener à leur oligomérisation et ralentirait leur diffusion.

Ensuite, l’influence de la co-expression des récepteurs CD4wt et CCR5wt sur l’organisation membranaire des récepteurs CCR5 et CD4 respectivement, a été étudiée.

D’une part, l’analyse des données a montré qu’en présence du récepteur CD4wt, la répartition entre les différents modes de diffusion du récepteur CCR5 est modifiée. La proportion de récepteurs CCR5 ayant une diffusion aléatoire diminue d’environ 10% sans que les coefficients de diffusion soient affectés. Conjointement, la proportion de récepteurs ayant une diffusion confinée augmente d’environ 10%, accompagné d’une augmentation des coefficients de diffusion et d’une légère diminution de la taille des domaines. Aucune influence sur les populations de récepteurs ayant une diffusion dirigée n’est observée. La co- expression du CD4wt modifiant l’organisation dynamique de CCR5, ces données suggèrent que les récepteurs CD4 et CCR5 sont en interaction.

D’autre part, il apparaît que la co-expression du récepteur CCR5wt modifie l’organisation membranaire du récepteur CD4. En effet, en présence du récepteur CCR5wt la proportion de récepteur CD4 ayant une diffusion aléatoire diminue d’environ 30% sans influence sur le coefficient de diffusion. La proportion de récepteurs ayant une diffusion dirigée n’est quant à elle pas modifiée, cependant un ralentissement d’environ un facteur 2 des vitesses et des coefficients de diffusion est observé. Enfin, la présence des récepteurs CCR5 induit l’augmentation d’environ 30% de la proportion de récepteurs confinés accompagnée d’une légère diminution de la taille des domaines et d’un ralentissement du coefficient de diffusion. L’ensemble des modifications sur l’organisation membranaire des récepteurs CD4 induite par la co-expression du récepteur CCR5wt indique là aussi que les récepteurs CD4 et CCR5 interagissent entre eux.

Figure 51 : Modèle proposé, à partir des résultats de SPT, pour l’organisation latérale des récepteurs CCR5 et CD4 co-exprimés. Les zones grises correspondent aux domaines membranaires où les récepteurs CD4 et CCR5 sont en interaction.

Récepteur CD4 Récepteur CCR5 Trajectoire dirigée Trajectoire aléatoire

La comparaison des effets induits respectivement par les récepteurs CD4wt et CCR5wt sur la diffusion latérale des récepteurs CCR5 et CD4 permet de proposer un modèle rendant compte de l’organisation membranaire des récepteurs CCR5 et CD4 co-exprimés (Fig. 51).

Premièrement, l’analyse des coefficients de diffusion des récepteurs confinés montre que les récepteurs CD4 et CCR5 interagissent au sein des domaines membranaires. En effet, la présence des récepteurs CD4wt induit l’augmentation des coefficients de diffusion des récepteurs CCR5 et le CCR5wt induit la diminution de ceux des récepteurs CD4 (Tableau 10). La différence d’un facteur 7 observée entre les coefficients de diffusion des récepteurs CD4 et CCR5 exprimés seuls se réduit alors à un facteur 2 lorsqu’ils sont exprimés avec leur co-récepteur au VIH. Ainsi, à la surface de la membrane plasmique, les récepteurs CD4 et CCR5 seraient, en partie, confinés dans des domaines d’environ 100 nm de rayon où ils seraient en interaction (Fig. 51).

A l’extérieur des domaines, quelle que soit la lignée étudiée, aucune influence sur les coefficients de diffusion des récepteurs ayant une diffusion aléatoire n’est observée. Il est donc possible de supposer que les récepteurs CCR5 et CD4 diffusant selon une diffusion aléatoire ne sont pas en interaction.

A l’inverse, au niveau des diffusions dirigées, un effet de la co-expression du CCR5wt sur le coefficient de diffusion et la vitesse est observé. Les paramètres diffusionnels des récepteurs CD4 en présence du récepteur CCR5wt sont similaires à ceux du récepteur CCR5 exprimés en présence du CD4wt (Tableau 11).

Ces données permettent de supposer qu’au moins une partie des récepteurs CD4 et CCR5 ayant une diffusion dirigée sont en interaction (Fig. 51). Cet effet est faible mais les résultats obtenus lors de la déstructuration du cytosquelette d’actine par la cytochalasine D supportent cette hypothèse. En effet, les expériences réalisées ont montré que lors de la co- expression des récepteurs CCR5 et CD4wt, la cytochalasine D ne modifie pas les proportions

Tableau 10 : Comparaison des paramètres diffusionnels obtenus pour les récepteurs confinés de différentes lignées.

Lignée D1-2 (x10-3) µm²/s DMACRO (x10-3) µm²/s Rayon moyen des domaines (nm) CD4 34 ± 43 0,2 ± 0.2 130± 100 CD4+CCR5wt 5,7 ± 7,1 0,3 ± 0.3 110 ± 60 CCR5 4,6 ± 4,8 0,7 ± 1 150 ± 90 CCR5+CD4wt 12 ± 14 0,7 ± 1 110 ± 100

Tableau 11 : Comparaison des paramètres diffusionnels obtenus pour les récepteurs ayant une diffusion dirigée pour différentes lignées.

Lignée D1-2 (x10-3) µm²/s Vitesse (x10-2) µm/s CD4 1,2 ± 1,5 2,0 ± 2,6 CD4+CCR5wt 0,5 ± 0,5 0,8 ± 0.9 CCR5 0,8 ± 0,8 2,0 ± 1,7 CCR5+CD4wt 0,7 ± 1,3 1,4 ± 1,3

de récepteurs ayant une diffusion dirigée comme c’est le cas lorsque les récepteurs CCR5 sont exprimés seuls. Ces données permettent elles aussi de supposer qu’au moins une partie des récepteurs CCR5 et CD4 ayant une diffusion dirigée sont en interaction.

En conclusion, les travaux réalisés en SPT démontrent que les récepteurs CD4 et CCR5 interagissent de façon constitutive. Comme illustré sur le modèle proposé (Fig. 50), cette interaction aurait lieu au sein de domaines membranaires. Les récepteurs ayant une diffusion dirigée seraient, au moins en partie, en interaction alors que les récepteurs diffusant selon une diffusion aléatoire n’interagiraient pas. Cependant, les données obtenues en SPT, ne fournissent pas d’éléments permettant de conclure quant à la stœchiométrie de l’interaction.

Chapitre V :

Analyses comparatives des données obtenues en