Le plasmide pRSET-A (Invitrogen) a été choisi par rapport à son étiquette de 6 histidines, sa résistance à l’ampicilline et sa taille est de 2 900 paires de bases (pbs). L’étiquette de 6His est connue pour faciliter la purification des protéines et pour ne pas gêner outre mesure le repliement de la protéine d’intérêt. Cette étiquette pose, en pratique, beaucoup moins de problème que l’étiquette GST. De plus, l’expression du gène d’intérêt est sous contrôle d’un promoteur fort, le T7 provenant du phage T7, qui conduit l’expression du gène.
Figure 37) Tests de PCR avec le plasmide pGex contenant l’insert HSP70-1
Gel d’agarose (1%) représentant un des tests de PCR réalisé avec le plasmide pGex-HSP70-1 en vue de l’obtention de l’insert HSP70-1. Les puits 2 à 5 correspondent à différentes conditions de PCR avec le même plasmide. Le puits 1 correspond aux marqueurs de tailles (en nombre de paires de bases).
Figure 38) Tests de PCR avec l’ADN génomique en vue d’obtenir l’insert HSP22 (test de différentes conditions et de différentes enzymes)
Gel d’agarose (1,2%) montrant un des tests de PCR avec l’ADN génomique en vue de l’obtention de l’insert HSP22. Les puits 2 à 8 correspondent à différentes conditions de PCR (différentes polymérases et différentes concentrations pour les réactifs). Le puits 1 correspond aux marqueurs de tailles (en nombre de paires de bases).
Figure 39) Ligation des deux inserts (HSP70-1 et HSP22) ainsi obtenus dans le plasmide pRSET-A
Gel d’agarose (0,9%) représentant les ligations des inserts obtenus par PCR avec le plasmide pRSET-A. Le puits 1 correspond au plasmide digéré par les deux enzymes de restriction qui ont servi au clonage : BamH1 et EcoR1. Le puits 2 correspond au plasmide+HSP22 linéarisé (digéré par BamH1). Le puits 3 correspond au plasmide+HSP70-1 linéarisé (digéré par BamH1).
Plasmide +HSP22 Plasmide +HSP70-1 Plasmide digéré 2 900 pbs 1 2 3 2 000 1 500 1 000 750 500 250 1 923 pbs 1 2 3 4 5 1 500 1 000 750 500 250 588 pbs 1 2 3 4 5 6 7 8
La T7 ARN polymérase reconnaît spécifiquement ce promoteur. Il est nécessaire d’apporter la T7 ARN polymérase aux bactéries soit en induisant l’expression de la polymérase par l’inducteur gratuit IPTG (concentration finale : 1 mM) ou soit en infectant les bactéries avec un phage exprimant la polymérase. Quand suffisamment de T7 ARN polymérase est produite, elle se fixe sur le promoteur T7 et transcrit le gène d’intérêt.
Les souches bactériennes Top10 et BL21 (DE3) PLysS sont utilisées respectivement pour le clonage et l’analyse plasmidique, et, pour l’expression protéique.
L’expression de la T7 ARN polymérase est entièrement régulée. La souche bactérienne BL21 (DE3) PLysS porte le lysogène DE3 du bactériophage λ. Le lysogène contient le gène du lacI, le gène codant pour la T7 ARN polymérase (sous contrôle du promoteur lacUV5) et une petite partie du gène lacZ codant pour l’enzyme β-galactosidase
qui est une enzyme utilisée pour la structure chez E.coli. Cette construction de lac est insérée dans le gène int, ce qui inactive ce gène int. La rupture du gène int empêche l’excision du
phage (i.e. la lyse) en absence de phage helper. Le lac répresseur (qui contrôle la transcription et l’expression des gènes structuraux) réprime ici l’expression de la T7 ARN polymérase. En effet, les gènes lac sont contrôlés par une régulation négative, c'est-à-dire qu’ils sont transcrits jusqu’à ce qu’ils soient inactivés par une protéine régulatrice. Etant donné que la fonction du gène régulateur est d’empêcher l’expression des gènes structuraux, il est appelé gène répresseur. L’addition d’IPTG (isopropylthiogalactoside, qui est un inducteur gratuit du
système c'est-à-dire qu’il induit la synthèse enzymatique mais n’est pas métabolisé) permet l’expression de la T7 ARN polymérase. La cible de l’IPTG est le gène répresseur.
Concernant la régulation de la T7 ARN polymérase par le lysozyme du T7 : le but recherché est de diminuer l’expression basale de la T7 ARN polymérase. Si un gène toxique est cloné en aval du promoteur T7, l’expression basale de ce gène peut conduire à la diminution de la croissance bactérienne, à la mort cellulaire ou à l’invisibilité du plasmide. Le T7 lysozyme (produit par le PLysS) se lie à la T7 ARN polymérase et inhibe ainsi son action de transcription. Cette propriété est exploitée dans le but de réduire le niveau basal d’expression de la T7 ARN polymérase. Le lysozyme est une enzyme bi-fonctionnelle : en addition à son activité de ligand de la T7 ARN polymérase, il clive aussi une liaison spécifique de la couche du peptidoglycane de la paroi de E.coli. Cette activité va faciliter la lyse bactérienne lors des cycles successifs chaud/froid lors des premières étapes de la purification.
Les inserts proviennent pour HSP70-1 du plasmide pGex Hsp70-1 et pour HSP22 de l’ADN génomique humain. Concernant l’insert HSP70-1 (1 923 pbs), plusieurs PCR ont été réalisées pour optimiser les conditions. La bande correspondant à l’insert (puits 5 de la figure 37 ; ce sont les seules conditions qui ont donné un résultat satisfaisant sur ce gel) à été directement découpée puis extraite du gel d’agarose en vue d’être purifiée et ensuite liguée avec le plasmide pRSET-A. L’ADN génomique humain a été utilisé pour obtenir l’insert HSP22. En effet, d’après le serveur web de bioinformatique Softberry Biotools (http://www.softberry.com/berry.phtml), le gène HSP22 ne comporte pas d’intron (partie
d’ADN non codante) mais est constitué d’un seul exon (partie d’ADN codante), ce qui permet
de réaliser une étape de PCR directe (c'est-à-dire sans passer par l’ADNc ou ADN complémentaire) pour obtenir l’insert. Ce procédé direct est rarement possible pour les gènes humains puisqu’ils possèdent généralement plusieurs introns. Ainsi pour le gène HSP70-1, ce n’est pas possible de procéder de la même manière (présence de 4 introns).
Le gel d’agarose de la figure 38 montre la dernière PCR optimisée pour l’insert HSP22 (588 pbs). Seules les conditions du puits 4, 7et 8 ont donné un résultat satisfaisant. La bande du puits numéro 4 a été coupée, purifiée et liguée dans le plasmide pRSET-A.
Figure 40) Positionnement des SQ/TQ sur le domaine ATPasique (HSP70)
Placement des sérines (en bleu) et la thréonine (en violet) correspondants aux domaines SQ/TQ (potentiellement phosphorylables par les kinases ATM/ATR). Image obtenue en utilisant le programme Pymol, ainsi que le fichier PDB du domaine ATPasique de HSP70 (humaine), (Osipiuk J et al, 1999, code PDB : 1S3X).
A) Représentation schématisée (flèches et hélices). B) Même vue que A mais représentation de la surface.
Figure 41) Prédiction de repliement (structure secondaire) du domaine C-terminal de HSP70-1 (résidus 383 à 641)
Prédiction de repliement réalisée à l’aide du logiciel FoldIndex trouvé à l’adresse suivante : http://bioportal.weizmann.ac.il/fldbin/findex.
S135 S254 T278
La figure 39 montre que les ligations concernant le plasmide pRSET-A et les deux gènes HSP22 et HSP70-1 semblent avoir fonctionné puisque les tailles obtenues sont supérieures à la taille du plasmide seul et correspondent pour le plasmide + HSP22 à 3,7 kpbs et pour le plasmide + HSP70-1 à 5,8 kpbs. Les clones plasmidiques ont ainsi été obtenus pour les deux gènes d’intérêt.A partir de cette étape, les expériences de cristallisation se sont arrêtées là, au profit des expériences de biologie moléculaire et cellulaire, et ce à cause du temps imparti pour terminer la thèse et jugé insuffisant pour mener à bien une étude cristallographique complète.
Cependant, des prédictions de structures (secondaires et tertiaires) ont été réalisées pour les deux protéines d’intérêt HSP22 et HSP70-1 (domaine C-terminal).