HSP70 est connue pour se déplacer depuis le cytoplasme jusqu’au noyau en cas de stress (Velazquez et Lindquist, 1984 ; Welch et Suhan, 1986) dans les cellules d’insecte et de rat. Est-ce aussi le cas pour les cellules d’origine humaine ?
Figure 67) Test de différentes lignées humaines mutées pour les protéines de réparation de l’ADN
Photographies (expériences d’immunofluorescence) réalisées après irradiation (30 Gy) avec une source conventionnelle (200 kV). Les temps de réparation sont indiqués au dessus des images. Les résultats concernant la localisation des HSP70 stress inductibles (TRITC ; rouge) sont présentés pour trois lignées cellulaires humaines : le contrôle (1BR3Neo), le mutant ATM-/- (AT5BIVA) et le mutant DNA-PK-/- (MO59J). En bas, sont indiquées par des flèches les différentes localisations prises par HSP70. Les images sont réalisées par microscope optique à fluorescence avec un grossissement 1000.
0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 10 MO59J AT5BIVA 1BR3Neo P our ce nt ag e de H S P 70 nu cl éai re
Temps après irradiation (30Gy) en heures
Figure 68) La navette nucléaire de HSP70 stress inductible après rayons X
Représentation graphique de la fraction de HSP70 nucléaire (par rapport à la fraction totale) en fonction du temps de réparation après irradiation par rayons X (30 Gy).
MO59J (DNA-PK -/-)
Temps après irradiation (30Gy): 0 h 1 h 4 h
1BR3Neo (contrôle)
AT5BIVA (ATM -/-)
Existe-il des différences suivant le type de stress ou la lignée cellulaire ? Et notamment, ce phénomène se produit-il dans la même mesure pour les lignées mutées dans les protéines de réparation ?
Des expériences d’immunofluorescence ont été réalisées pour étudier la localisation des HSP70 inductibles par le stress dans différentes lignées cellulaires mutées dans les protéines de réparation et ce après différents stress. L’effet des radiations ionisantes sur la localisation de HSP70 est étudié. La localisation de HSP70 est analysée après irradiation par rayons X (30 Gy) sur différentes lignées cellulaires mutées pour les protéines de réparation (figures 67 et 68). HSP70 (stress inductible) possède la particularité de réaliser un déplacement depuis le cytoplasme jusqu’au noyau en cas de stress et ce seulement dans les cellules non mutées dans les protéines de la réparation de l’ADN, après une exposition aux rayons X. HSP70 réintègre ensuite le cytoplasme après stress, lorsque les conditions physiologiques reviennent à la normale. Ce déplacement entre le cytoplasme et le noyau existe aussi dans les cellules humaines et il a été nommé : « navette nucléaire ou nucleoshuttling » de HSP70 après stress. Une absence totale de déplacement est observée lorsque ATM est mutée, ce qui suggère un rôle prédominant de ATM dans le déplacement de HSP70 stress inductible. La ligne mutée en DNA-PK montre, quant à elle, un phénotype retardé pour la navette nucléaire. Le phénomène de navette nucléaire réalisée par HSP70 après stress est visualisé plus clairement sur le graphique (figure 68). La navette nucléaire est nettement visible pour le témoin 1BR3Neo (courbe rouge).
Remarque : Une augmentation entre 4 et 8 heures de réparation pour la lignée mutée en ATM est remarquée sur la courbe verte correspondant au mutant ATM-/-. Ceci s’expliquerait par la présence de la protéine ATR (non mutée dans cette lignée) qui prend le relais de ATM déficiente (Foray N et al, 2002). Ceci sous entend que la localisation nucléaire serait contrôlée par ATM et dans une moindre mesure par ATR.
Ce phénomène de navette nucléaire est-il ou non dépendant de la dose d’irradiation reçue par les cellules ? Une irradiation avec une dose quinze fois plus faible (2 Gy) a été testée sur les cellules témoins (figure 69). La dose n’apparaît pas être essentielle au déplacement de HSP70 du cytoplasme au noyau après irradiation par rayons X, puisque, même à 2 Gy, la navette nucléaire s’avère être effectuée.
D’autres stress ont été ensuite testés, en utilisant la même méthode, et notamment l’irradiation par les UV et la soumission des cellules à un champ magnétique (à l’aide d’une source du CRSSA). La localisation de la protéine HSP70 après UV (20 J/m2) a été testée dans différentes lignées cellulaires mutées dans les protéines de réparation de l’ADN (figure 70).
Après UV, le phénomène de navette nucléaire est observable, même s’il n’a pas la même amplitude. La fraction nucléaire de HSP70 stress inductible n’atteint pas le même maximum qu’en cas d’irradiation par rayons X (voir figures 68 et 70). L’effet visible se révèle plus précoce qu’après irradiation par rayons X, ce qui pourrait être corrélé avec les vitesses de réparation des différents types de dommages créés par les rayons X et par les UV (voir chapitre I ; Goodhead DT, 1989). Ces résultats soulignent également le rôle de DNA-PK et ATM pour la navette nucléaire réalisée par HSP70 après stress. Les kinases DNA-PK et ATM apparaissent comme étant requises pour la navette nucléaire, induite par le rayonnement X et par le rayonnent UV, de la protéine chaperonne HSP70 inductible (correspondant très probablement à un mélange de plusieurs HSP70 très proches, dont HSP72 notamment). ATR joue sans doute aussi un rôle dans cet aller-retour de HSP70 du cytoplasme au noyau. Les résultats obtenus après irradiation avec des champs magnétiques ne sont pas présentés ici par souhait de la collaboratrice du CRSSA. Il faut néanmoins ajouter que l’effet produit après ce stress est un phénomène de navette nucléaire pour HSP70 et que cet effet est bien marqué.
Figure 69) La navette nucléaire de HSP70 stress inductible dans des cellules 1BR3 après rayons X (2Gy)
Les photographies d’expériences d’immunofluorescence ci-dessus sont réalisées après irradiation (2 Gy), avec une source conventionnelle (200 kV). Les temps de réparation sont indiqués au dessus des photographies. Les résultats concernant la localisation des HSP70 stress inductibles (TRITC ; rouge) sont présentés pour une lignée fibroblastique humaine non transformée (1BR3). Les noyaux des cellules sont marqués à l’aide du Dapi (bleu). Les images sont réalisées avec un grossissement 1000.
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 120 140 1BR3Neo MO59J HCC1937 P ource nt ag e de H S P 70 n ucl éaire
Temps après UV (20 J/m2) en minutes
Figure 70) La navette nucléaire de HSP70 après UV
Représentation graphique de la fraction de nucléaire de HSP70 en fonction du temps de réparation après irradiation UV (20 J/m2). Les temps de réparation (cellules maintenues à 37°C, 5% de CO2) sont indiqués en abscisse. La fraction de HSP70 nucléaire par rapport à la fraction totale est indiquée en ordonnée. Les résultats concernant la localisation des HSP70 stress inductibles sont présentés pour trois lignées cellulaires humaines : le contrôle (1BR3Neo), le mutant BRCA1-/- (HCC1937) et le mutant DNA-PK-/- (MO59J).
4 h 24 h
Dapi Dapi Dapi Dapi
HSP70 HSP70 HSP70 HSP70
1 h 10 min
Les autres stress testés (incubation avec H2O2 ou avec cis-platine) n’ont, quant à eux, pas montré de variation marquée concernant la localisation de la protéine HSP70.