La place du soignant

Para a detecção de miRNAs e mRNAs previamente caracterizados existem duas técnicas disponíveis: microarranjos e PCR quantitativa (qPCR, do inglês quantitative

polymerase chain reaction), também chamada de PCR em tempo real (RT-qPCR, do inglês Reverse Transcription quantitative PCR). Quando se deseja obter um perfil de todos os RNAs

em determinada amostra ou quando não há conhecimento prévio dos miRNAs e mRNAs presentes, é utilizado o NGS (Figura 7) (ETHERIDGE et al., 2013). As três técnicas têm sido usadas amplamente e com sucesso para avaliar o espectro de miRNAs em células e tecidos. No entanto, cada método apresenta desafios únicos na obtenção do perfil de miRNAs, especialmente de miRNAs circulantes, uma vez que sua concentração é baixa, tornando mais difícil medi-la de forma consistente e acurada (ETHERIDGE et al., 2013). Por exemplo, na análise por microarranjos, o desenho das sondas é restringido pelo pequeno tamanho das sequências do miRNA maduro, tendo toda sua sequência usada como sonda e, consequentemente, grandes variações na temperatura de desnaturação; ensaios de qPCR dependem da alta especificidade de sondas; e NGS pode ter erros introduzidos pela sequência de adaptadores. Um desafio que todas estas técnicas têm em comum é a distinção entre miRNAs da mesma família, que podem variar em apenas um nucleotídeo, mas ter padrões de expressão diferenciados (GIT et al., 2010). O método mais comum tem sido a qPCR devido à sua sensibilidade e ao número limitado de miRNAs conhecidos, contudo, é ineficiente em uma escala genômica (GIT et al., 2010). Em contrapartida, o NGS resolve problemas relacionados com a similaridade e o tamanho das sequências de miRNA e fornece um perfil com grande espectro de miRNAs, conhecidos e não conhecidos, em um único experimento (LEE et al., 2010).

De um modo geral, a qPCR começa com a conversão do RNA alvo para um DNA complementar (cDNA) pela adição de uma cauda poli-A com primer oligo-d(T) ou pela adição de um sítio de ligação com um stem-loop primer (usada pelo sistema TaqMan) (Figura 7a). A partir daí, ela é baseada na técnica de PCR combinada com fluorescência, que coleta continuamente esses sinais ao longo de um número de ciclos. A técnica culmina com a conversão dos sinais de fluorescência em um valor numérico para cada reação, onde o aumento da fluorescência pode ser diretamente proporcional ao aumento do produto amplificado durante a PCR (DORAK, 2006; PRITCHARD, CHENG e TEWARI, 2012).

Apesar de a qPCR ter como principais vantagens a alta sensibilidade e especificidade, existem algumas considerações críticas para a padronização da técnica a fim de obter alta reprodutibilidade, que inclui a consistência dos reagentes utilizados, o desenho do experimento, os controles/normalizadores e os métodos de análise (BUSTIN e NOLAN, 2004). Entre esses pontos, possivelmente o mais criticado era a escolha dos controles/ normalizadores. No entanto, a introdução de versões sintéticas de miRNAs de outros organismos, como C. elegans quando se estudam amostras humanas (MITCHELL et al., 2008), no plasma/soro durante a extração de RNA, tem se mostrado útil e eficiente para normalizar os dados obtidos por qPCR (CORTEZ et al., 2011). Outra dificuldade é que as condições ótimas da reação podem variar substancialmente entre miRNAs com relação à temperatura de anelamento dos primers devido a diferenças de sequência. Uma estratégia que foi aplicada com sucesso a fim de padronizar as condições de hibridização para analisar grandes números de miRNAs simultaneamente foi a incorporação de locked nucleic acids (LNAs) aos primers (PRITCHARD, CHENG e TEWARI, 2012). Estes são nucleotídeos modificados com uma ligação entre o oxigênio 2’ e o carbono 4’ da ribose, conferindo uma conformação rígida (locked) que é ideal para a ligação de bases. Como essa ligação reduz a flexibilidade do DNA, as propriedades de hibridização (uma melting temperature maior) aumentam a especificidade (VESTER e WENGEL, 2004).

Figura 7. Exemplos de técnicas para detecção de miRNAs.

Fonte: adaptado de Pritchard, Cheng e Tewari (2012).

a) PCR quantitativa, onde primers stem-loop específicos para o miRNA são usados pelo sistema TaqMan (acima à esquerda). Amplicons são gerados com um forward primer específico para o miRNA alvo e um reverse primer. Durante a amplificação, quando uma sonda TaqMan é hidrolisada, um sinal de fluorescência é emitido (acima ao meio). Em outra abordagem, o miRNA recebe uma cauda poli-A na região 3’ e um oligo-d(T) é usado como

primer para a transcrição reversa (abaixo à esquerda). Em seguida, um forward primer específico para o miRNA

e um reverse primer, que se anela à região 3’ do miRNA e também à cauda poli-A são usados para a amplificação, onde o corante SYBR Green é intercalado na dupla fita de DNA (abaixo ao meio). Os primers podem ou não incorporar locked nucleic acids. b) Microarranjos de miRNA usam sondas de captura (que também podem ou não incorporar locked nucleic acids) para miRNAs marcados com fluorescência. c) Sequenciamento de RNA (RNA-seq) começa com a transcrição reversa de uma biblioteca de miRNA para uma biblioteca de cDNA. Adaptadores acrescentados durante a construção da biblioteca permitem que o cDNA seja ligado em uma fase sólida, como na plataforma da Illumina, ou a microesferas, como nas plataformas da Roche e ABI.

Técnicas de NGS aplicadas para detectar o perfil de RNA são denominadas RNA-seq, que se baseiam no sequenciamento de fragmentos de cDNA gerados a partir de bibliotecas de RNA total. As bibliotecas são preparadas ligando adaptadores nas extremidades 3’ e 5’ do RNA na amostra e, então, os fragmentos convertidos em cDNA são selecionados pelo tamanho. Em seguida, esse cDNA é ligado em uma fase sólida ou em microesferas que contêm oligonucleotídeos complementares aos adaptadores. Com isto, ocorre a amplificação dos fragmentos, que serão, finalmente, sequenciados base por base (Figura 7c).

As principais vantagens do sequenciamento são a detecção de miRNAs conhecidos e novos e a identificação precisa das sequências de miRNA. Por exemplo, é possível distinguir miRNAs que diferem por apenas um nucleotídeo, bem como isomirs de diferentes tamanhos (LEE et al., 2010). Isomirs correspondem a miRNAs maduros que têm variações especialmente nas regiões 5’ e 3’ e que podem ser originados de modificações na posição de corte pelas enzimas Drosha ou Dicer durante a biogênese (MORIN et al., 2008). No entanto, estudos de RNA-seq costumam identificar um grande número de novas sequências de pequenos RNAs que podem ser ou não verdadeiros miRNAs (CHIANG et al., 2010).

Apesar do número de miRNAs conhecidos ter aumentado significativamente desde o advento de técnicas de NGS, a descoberta de novos miRNAs ainda é uma tarefa difícil que requer integração de métodos experimentais e computacionais. Vários algoritmos de predição de miRNAs baseados nas características dessas moléculas foram desenvolvidos para identificar novos miRNAs (GOMES et al., 2013).