Interprétations et discussions

O efeito da hipotensão pós-exercício (HPE) tem sido amplamente estudado, especialmente em resposta ao exercício aeróbio (ANUNCIACAO e POLITO, 2011). Deste modo, a prática regular de exercício físico a fim de controlar a hipertensão tem sido frequentemente indicada, complementando tratamentos farmacológicos (MACDONALD, 2002; MORAES-TEIXEIRA et al., 2010). Contudo, a determinação adequada da intensidade do exercício para maximizar o efeito da HPE é importante. O treinamento de oito semanas em duas intensidades diferentes nos ratos hipertensos mostrou uma clara diferença no efeito hipotensor pós-exercício.

Antes do início do treinamento, os animais do grupo controle, EBI e EAI apresentavam pressão arterial sistólica elevada (168,6 ± 3,6 mm Hg) em relação a ratos normotensos (122-148 mm Hg) (OKAMOTO e AOKI, 1963). Com quatro semanas de treinamento, houve uma diminuição não significativa estatisticamente nos dois grupos de exercício: 159,33 ± 3,07 mm Hg no EBI e 157 ± 8,51 mm Hg no EAI. Entretanto, após as oito semanas, foi observada uma diminuição significativa de 9,6% para o grupo EBI e de 19,2% para o EAI, sendo que o grupo controle apresentou um aumento de 8% na pressão arterial (Gráfico 6).

Os dados do nosso grupo mostram que o exercício não apenas impediu a evolução da hipertensão, como reduziu a pressão dos animais exercitados, confirmando a resposta do efeito hipotensor pós-exercício. Além disso, como houve uma redução mais significativa nos

animais do grupo EAI que do EBI, tais resultados confirmam que a intensidade de exercício influencia a magnitude do efeito hipotensor pós-exercício, como observado anteriormente (JONES et al., 2007; MORAIS et al., 2011).

6.2.3 PCR quantitativa

Apesar dos avanços tecnológicos para detectar miRNAs circulantes, divergências na medição de concentração de miRNAs entre diferentes plataformas, como observado neste trabalho, já foram reportadas previamente (ACH, WANG e CURRY, 2008; SATO et al., 2009; WANG, K., 2012b). Com apenas cinco miRNAs em comum, os resultados para plasma apresentaram uma baixa consistência entre as plataformas de qPCR TaqMan e Exiqon (Tabela 6). A única semelhança entre os dados das plataformas foi com relação ao miR-130a, que diminuiu nos dois grupos de exercício. Foi mostrado que o miR-130a pode estar envolvido com a proliferação de VSMCs durante a hipertensão (WU et al., 2011) e a proliferação de células endoteliais (CHEN e GORSKI, 2008). Wu e colaboradores (2011) mostraram que o miR-130a é regulado positivamente na aorta torácica e na artéria mesentérica de animais SHR, além de promover a proliferação de VSMCs (WU et al., 2011). As VSMCs de SHR proliferam mais rápido que de ratos Wistar e essa excessiva multiplicação pode aumentar a espessura dos vasos, resultando em hipertensão (BERK et al., 1989; TANNER et al., 2003). Desse modo, é possível que a diminuição do miR-130a observada no presente trabalho tenha proporcionado ou refletido, em parte, a queda de pressão arterial nos ratos exercitados. Contudo, esse miRNA não apresentou diferenças significativas pelo sequenciamento, sendo necessária a confirmação de sua expressão para poder confirmar essa relação.

Levando em consideração os resultados obtidos com TaqMan, as mudanças em plasma no grupo EBI (Gráfico 9) assemelham-se às alterações do miR-1 e -133a nos corredores recreacionais, onde ambos aumentaram com o exercício. No entanto, existe uma grande diferença entre os dois experimentos, não podendo necessariamente ser feita uma comparação direta entre os resultados: o experimento com humanos analisa uma resposta aguda, enquanto o com ratos verifica uma resposta crônica. O momento da coleta de sangue dos corredores recreacionais foi imediatamente após o término da corrida e a dos ratos aconteceu 24h depois do último exercício. Já foi mostrado que o perfil de miRNAs em resposta a um estímulo de exercício costuma ser relativamente rápido, retornando a níveis basais em pouco tempo.

Nielsen e colaboradores (2010) verificaram que myomiRs em músculo esquelético de humanos submetidos a 12 semanas de exercício aeróbio diminuíram, mas, após duas semanas sem treino, retornaram aos níveis iniciais (NIELSEN et al., 2010). Cumpre ressaltar que o estudo mencionado foi ilustrativo e seus resultados não podem ser comparados com os dados discutidos neste trabalho, uma vez que são amostras de tecidos distintos e a coleta do material foi feita em diferentes tempos. Como não foram coletadas amostras em um intervalo de tempo menor, não foi possível determinar em quanto tempo os miRNAs voltaram aos níveis basais. Contudo, isso indica que os myomiRs se ajustam rapidamente ao corrente estado de atividade física (NIELSEN et al., 2010). Além dessa diferença, estão sendo comparadas amostras de espécies distintas. É possível que haja discrepâncias entre resultados obtidos com humanos e ratos, por exemplo.

No músculo esquelético, a diminuição do miR-1 e 133a no grupo EAI (Gráfico 8) está de acordo com resultados obtidos por Drummond et al. (2008) e McCarthy e Esser, (2008) respectivamente, apesar do primeiro grupo ter estudado os efeitos do exercício resistido em humanos (MCCARTHY e ESSER, 2007; DRUMMOND et al., 2008). A diminuição desses dois miRNAs e do 206 em EBI e EAI também concorda com a observação do grupo de Nielsen (2010), mencionado acima, que usou diferentes intensidades de exercício durante o período de treinamento. O grupo observou que a expressão basal dos myomiRs diminuiu após o treinamento de 12 semanas, ou seja, com o exercício crônico (NIELSEN et al., 2010). Aqui, foi observada uma diminuição dos três myomiRs no grupo EAI e do miR-133a e -206 no EBI após treinamento de oito semanas.

Os resultados obtidos para miRNAs circulantes usando a plataforma Exiqon mostraram diferenças significativas em miRs expressos em músculo (1, 133a e 133b), rins (192, 215, 26, 24 e membros da família let-7), adipócitos (30b), VSMCs (143) e envolvidos com desenvolvimento muscular (181a) e angiogênese (328). Alguns desses também apresentaram alterações significativas pelo sequenciamento (ver item 6.2.4).

6.2.4 Sequenciamento de RNA

Os estudos de miRNA e exercício ainda estão na sua infância, onde poucos esforços têm sido feitos para obter um perfil completo dessas moléculas tanto no músculo esquelético quanto em plasma. Pelo nosso conhecimento, esse é o primeiro estudo a obter tal perfil.

Sequenciamento de próxima geração foi usado para ter uma visão geral dos miRNAs circulantes e de miRNAs e mRNAs em músculo esquelético de ratos hipertensos sedentários e submetidos a exercício de baixa e alta intensidade.

Como reportado previamente, uma proporção significativa de RNA encontrado no plasma é originária de diferentes espécies (WANG, K. et al., 2012a; ZHANG et al., 2012), principalmente bactérias e fungos (Gráfico 10 A e Tabela 8). Wang, K., et al. (2012a) observaram diversas e numerosas sequências que obtiveram complementaridade perfeita com sequências de bactérias, sugerindo que o perfil de RNA no sangue reflete a população da microbiota. Recentes evidências apontam para uma nova visão do corpo humano (e de outros mamíferos), onde esse não é isolado do ambiente externo e surge a hipótese que moléculas de RNA exógeno exercem influência na saúde/doença (WANG, K. et al., 2012a). A microbiota parece estar ligada à obesidade (LEY et al., 2006; FEI e ZHAO, 2013; YIN et al., 2013), bem como ser alterada pelo exercício físico (MATSUMOTO et al., 2008) e hipertensão (XU et al., 2013). Resultados do estudo do nosso grupo com fezes obtidas de ratos normais (Wistar), obesos (Zucker) e hipertensos (SHR) treinados por quatro semanas mostraram que o exercício alterou a microbiota dos ratos Zucker e SHR, além de indicar uma correlação entre certos gêneros de bactérias da microbiota com a concentração de lactato (dados não publicados, Petriz et al.). Uma análise cuidadosa do repertório de RNA de bactérias encontrado no plasma dos animais SHR é de interesse para verificar sua relação com o exercício e a hipertensão, bem como futuros estudos com as fezes que foram coletadas desses animais.

6.2.4.1 miRNA em tecido esquelético

Uma surpresa em nossos resultados foi que não se observou nenhuma alteração significativa nos miRNAs em tecido após o exercício. Diferenças de expressão de certos miRNAs foram mostradas em estudos anteriores, cujo tempo de coleta (time point) de material deu-se imediatamente, 3h, 6h, 48h e 14 dias depois do exercício (MCCARTHY e ESSER, 2007; DRUMMOND et al., 2008; SAFDAR et al., 2009; DAVIDSEN et al., 2010; NIELSEN et al., 2010). Essa divergência de resultados pode ser devida ao momento da coleta do material no nosso trabalho, aproximadamente 24h após o último exercício. Apenas Aoi e colaboradores (2010) coletaram as amostras de músculo no mesmo tempo que o presente estudo para verificar, por microarranjo, a resposta de miRNAs ao exercício crônico (corrida

por quatro semanas) em gastrocnêmio de camundongos. As análises desse grupo mostraram um aumento do miR-21 e uma diminuição do miR-696, -709 e -720 (AOI et al., 2010). Entretanto, é importante ressaltar que os estudos mencionados não invalidam os dados obtidos no presente trabalho. Pouco se sabe sobre a cinética de miRNAs tanto em células quanto na circulação, de modo que não é possível, no momento, estabelecer a curva e/ou ciclo de síntese e degradação e se são alterados com estímulos externos, como o exercício. Há sugestões que o espectro de miRNA e sua expressão se adapta rapidamente às condições correntes de atividade física do organismo (NIELSEN et al., 2010). Como essa observação deu-se apenas 3h, 48h e 14 dias depois de cessado o exercício, há a necessidade de experimentos com diversos tempos de coleta de material nesse intervalo, a fim de estabelecer a dinâmica de miRNAs para a melhor compreensão desse importante aspecto. Ademais, os tipos de músculo esquelético analisados nos mencionados trabalhos são heterogêneos, um fator que pode ser importante para o perfil de miRNAs.

6.2.4.2 RNA mensageiro em tecido esquelético

Em compensação, foi possível verificar no presente estudo uma interessante relação inversa entre a expressão de certos miRNAs circulantes e mRNAs no músculo. Usando duas ferramentas online que predizem alvos de miRNAs (miRecords e TargetScan), foi observado que alguns mRNAs que aumentaram após o exercício são alvo de miRNAs que apresentaram níveis alterados no plasma. Estudos demonstram que costuma haver uma relação inversa entre a expressão do miRNA e seu correspondente mRNA alvo (GUO et al., 2010). Essa relação foi observada para cinco miRNAs que diminuíram em, pelo menos, um dos grupos de exercício, enquanto seus alvos aumentaram em EBI e EAI (Tabela 13). No entanto, o miR-182, que não foi detectado no grupo controle e pode ter como alvo o Nrf1, importante na biogênese mitocondrial, apresentou uma relação direta com seu alvo predito. Tal observação sugere que essa regulação pode ser mais complexa e envolva outros mecanismos, uma vez que um mesmo mRNA pode ser alvo de vários miRNAs. Além disso, não se sabe como é a relação entre miRNA circulante e seu alvo em músculo esquelético.

De modo geral, as respostas de adaptação ao exercício crônico incluem mudanças na expressão de proteínas enzimáticas, regulatórias e de miofibras que aumentam a eficiência da utilização de substratos metabólicos durante o exercício (PILEGAARD et al., 2000). Os

mRNAs que aumentaram em, ao menos, um dos grupos de exercício podem estar envolvidos em vias possivelmente ativadas durante o exercício físico, como biogênese mitocondrial, biossíntese de ácidos graxos e proliferação e divisão celular (Tabela 12), refletindo a adaptação ao exercício. O exercício físico demanda maior geração de energia, que é promovida pela indução da biogênese mitocondrial (MAHONEY e TARNOPOLSKY, 2005). O Nrf1, que apresentou aumento com o exercício de baixa e alta intensidade, é um dos principais genes dessa via, controlando vários genes responsáveis pela fosforilação oxidativa (KELLY e SCARPULLA, 2004; HOCK e KRALLI, 2009). Foi mostrado em ratos que a ativação desse gene é causada pelo exercício físico (MURAKAMI et al., 1998), apesar de requerer a ativação paralela de outras vias para induzir a biogênese mitocondrial durante o exercício (BAAR et al., 2003). Além desse papel, o Nrf1 também pode regular genes que controlam o ciclo e a proliferação celular (WANG et al., 2006). A via de fosforilação oxidativa teve um representante nos nossos resultados, o Ndufa9, que aumentou em EBI e EAI. Esses resultados podem indicar um aumento da biogênese mitocondrial nos ratos exercitados.

Por sua vez, ácidos graxos podem funcionar como um combustível para o funcionamento das mitocôndrias (HOROWITZ, 2003). Assim, a biossíntese de ácidos graxos, de cujo gene Oxsm faz parte, pode ser importante para um aumento da atividade mitocondrial. Apesar do gene Oxsm ter aumentado nos dois grupos de animais exercitados, seus níveis aumentaram o dobro em EAI em relação a EBI, podendo indicar maior atividade/demanda no exercício de alta intensidade. Adicionalmente, foi reportado um aumento da síntese de triglicerídeos (que são formados por ácidos graxos) intramusculares em indivíduos submetidos a uma sessão de exercício moderado. Também foi observada uma redução no acúmulo de metabólitos de ácidos graxos no músculo esquelético e da ativação de vias inflamatórias nesses indivíduos. A diminuição de metabólitos de ácidos graxos devido ao aumento da síntese de triglicerídeos pode melhorar a sensibilidade à insulina. Dessa forma, os autores sugeriram que a síntese de triglicerídeos intramusculares pode ser um importante mecanismo responsável pela proteção à resistência à insulina induzida por ácidos graxos (SCHENK e HOROWITZ, 2007). Em conjunto, esses resultados podem confirmar o aumento da atividade mitocondrial causada pelo exercício, bem como uma possível melhora da sensibilidade à insulina nesses animais. Contudo, futuros estudos são necessários para confirmar tal relação. Desta forma, as alterações nos genes Nrf1 e Ndufa9, que podem indicar

um aumento na biogênese mitocondrial, e no Oxsm, que pode sugerir aumento da atividade mitocondrial, podem indicar que o exercício aumentou a biogênese mitocondrial e, consequentemente, a atividade mitocondrial.

A síntese de ácidos graxos também pode estar relacionada à necessidade de prover glicerofosfolipídeos para produção de membrana celular (DOLCE et al., 2011). Uma vez que o exercício pode aumentar a divisão e a proliferação celular, é possível que a maior concentração dos genes LOC497978 e Agpat6, que participam do metabolismo de glicerofosfolipídeos, aumentaram em EBI e EAI para essa finalidade.

Consistente com essa observação, tem sido mostrado em humanos que o exercício é capaz de estimular células satélites a reiniciar o ciclo celular e a proliferar (MACKEY et al., 2007) e que apenas uma sessão de exercício pode ter essa consequência (CRAMERI et al., 2004; DREYER et al., 2006; O'REILLY et al., 2008). Os efeitos positivos do exercício na proliferação celular têm sido demonstrados em diferentes tecidos (FERRER-ALCON et al., 2008; NAKAJIMA et al., 2010; SASAKI et al., 2012). Um grupo verificou que corrida voluntária em camundongos adultos aumentou a proliferação celular, bem como a neurogênese em células do hipocampo (VAN PRAAG, KEMPERMANN e GAGE, 1999). Desde então, outras pesquisas têm reforçado o papel do exercício na neurogênese em indivíduos adultos (BROWN et al., 2003; VAN PRAAG et al., 2005; KRONENBERG et al., 2006; BRANDT et al., 2010). Um estudo sugeriu o envolvimento do Igf1 nos efeitos neuroprotetores causados pelo exercício de baixa intensidade em camundongos com doença neuromotora (FERRER-ALCON et al., 2008). Além dos efeitos em células neuronais, foi mostrado que células satélites do gastrocnêmio mantêm seu potencial proliferativo, permitindo a hipertrofia (MARSH et al., 1997). Portanto, o aumento observado neste trabalho de genes envolvidos com a proliferação e a divisão celular pode indicar tal efeito, especialmente no gastrocnêmio. Além do papel do Igf1 na regulação da hipertrofia muscular, ele é um possível alvo do miR-1, onde uma relação entre esses já foi mostrada em resposta a exercício resistido (MCCARTHY e ESSER, 2007). O aumento aqui observado do Igf1 nos grupos submetidos a exercício em conjunto com o aumento de biogênese mitocondrial pode indicar que houve hipertrofia no gastrocnêmio.

Um gene expresso com diferença significativa nos grupos de exercício e que pode participar da contração de músculo liso vascular e estar envolvido com a hipertensão é o Prkaca. A observação desse gene é consistente com a presença de vasos sanguíneos no

músculo esquelético. A interação entre o produto do Prkaca com o do gene Thop1 foi mostrada (TULLAI et al., 2000), sugerindo seu papel na regulação da via renina-angiotensina, da qual o Thop1 faz parte. O gene Prkaca corresponde a uma subunidade catalítica da proteína quinase A (PKA, do inglês protein kinase A) (SOBERG et al., 2012), que pode estar envolvida no processo de contração de músculo liso vascular. A atividade dessa proteína sobre a proliferação celular parece acontecer de modo diferente em diversos tecidos. Nas células de Schwann, por exemplo, o aumento da atividade de PKA aumenta a divisão celular, enquanto que em VSMCs, seu aumento pode inibir a divisão e proliferação celular (INDOLFI et al., 1997; WILKES, CHARITAKIS e BASSON, 2006). Uma vez que a proliferação aberrante de células VSMCs contribui para o estado hipertenso, o aumento aqui observado do Prkaca com exercício de baixa e alta intensidade pode estar associado ao efeito hipotensor pós exercício. Todavia, futuros estudos são necessários para confirmar essa relação, uma vez que tal alteração foi verificada em músculo esquelético, mesmo o exercício sendo capaz de aumentar a angiogênese neste tecido.

Desta forma, os dados obtidos e discutidos aqui sobre mRNA em tecido muscular indicam correlações consistentes com os efeitos crônicos documentados decorrentes da adaptação ao exercício físico.

6.2.4.3 miRNA em plasma

O desenvolvimento das técnicas de NGS permitiu a oportunidade de uma melhor compreensão do perfil de miRNAs circulantes, uma vez que é possível realizar o experimento com menor concentração de RNA e este é relativamente escasso em plasma e soro, por exemplo (WANG et al., 2013). Adicionalmente, é uma técnica mais sensível que a qPCR, onde é possível distinguir miRNAs que diferem por apenas uma base (LEE et al., 2010). Assim, foi obtido um perfil amplo de miRNA em plasma, onde apenas 28 de 285 apresentaram diferença significativa nos grupos de ratos exercitados quando comparados com o grupo sedentário (Figura 14). Vários dos miRNAs diferencialmente expressos ainda não haviam sido relacionados com a resposta ao exercício. Entre os miRNAs com diferença de expressão encontram-se miRNAs expressos em músculo (miR-133a), rins (miR-215, -192, -24, -26a e let-7c), endotélio (miR-126a), adipócitos (miR-30c-5p) e possivelmente envolvidos com hipertensão e regeneração muscular (miR-29a) e desenvolvimento muscular

(miR-181c). MiRNAs com diferença de expressão nas duas intensidades de exercício incluem o 30c, 215, 182, let-7c, 328 e 146b.

Foi observada uma diminuição do myomiR 133a apenas no grupo EAI quando comparado com o controle. De acordo com Nielsen et al. (2010), a expressão basal desse myomiR, bem como do miR-1, -133b e -206, em músculo de humanos diminuiu após 12 semanas de treinamento aeróbio, enquanto o exercício agudo após esse período não alterou seus níveis (NIELSEN et al., 2010). Apesar de comparar estudos com diferentes espécies e tecidos, a diminuição do miR-133a neste trabalho condiz com a observação de Nielsen et al. (2010) que esse myomiR tem a expressão basal diminuída em indivíduos treinados (NIELSEN et al., 2010). O presente estudo parece ser o primeiro comparando as alterações de miRNAs no plasma e tecido. Como observado anteriormente, é importante destacar que a cinética dessas moléculas não é bem conhecida e que o miR-133a, entre outros miRNAs, pode apresentar alterações em diversos tempos de coleta de material, diferentes das 24h após o exercício. Adicionalmente, não é sabido se existe uma correlação, direta ou indireta, entre a expressão de miRNAs em plasma e tecido em função do exercício e em que período de tempo é possível observa-la. Futuros estudos para responder a tais questões serão importantes para melhor compreender o mecanismo dessas moléculas sob o estímulo do exercício e estabelecer sua cinética. Contudo, o resultado aqui observado confirma o papel do miR-133a na plasticidade do músculo esquelético decorrente do exercício, possivelmente permitindo a expressão de genes importantes para o crescimento muscular, como sugerido por McCarthy e Esser (2007).

Recentemente, Liu et al. (2013) sugeriram que o miR-133a pode estar envolvido com a regulação de adipócitos. O tecido adiposo branco (TAB) armazena lipídeos, podendo levar à obesidade, resistência à insulina e diabetes tipo 2, enquanto o tecido adiposo marrom (TAM) gera calor a partir dos lipídeos armazenados, aumenta a sensibilidade à insulina e tem correlação negativa com a incidência de diabetes tipo 2 (LIU et al., 2013). Os myomiRs canônicos parecem ser enriquecidos no TAM, que contém mais mitocôndrias que o TAB (WALDEN et al., 2009). Contudo, o TAB é plástico e pode conter um tipo intermediário de células: adipócitos beges. Em humanos e camundongos, o gene que regula essa transformação, Prdm16, é um alvo do miR-133a. Níveis reduzidos do miR-133a in vivo aumentam a conversão de adipócitos brancos em adipócitos beges, melhorando a sensibilidade à insulina (LIU et al., 2013). Possivelmente, a redução no nível de miR-133a em

EAI aqui observada melhorou a sensibilidade à insulina nesses animais, já que este é um dos possíveis benefícios da prática de exercício (HAWLEY, 2004).

Existe a sugestão que o miR-30c participa do processo de adipogênese (KARBIENER et al., 2011; ZARAGOSI et al., 2011). Dois estudos observaram uma expressão aumentada desse miRNA durante a adipogênese in vitro. Como esse processo pode contribuir para a obesidade (STEPHENS, 2012) e o exercício pode reduzi-la e preveni-la (POIRIER e DESPRES, 2001), é possível que a diminuição do miR-30c observada no presente trabalho indique uma redução da adipogênese devido ao exercício, tanto de baixa quanto de alta intensidade.

Em estudo anterior, o miR-181a e -181b, mas não o -181c, foram detectados em mioblastos em cultura e podem ter papel na sua proliferação e diferenciação, uma vez que estavam aumentados durante a regeneração muscular (NAGUIBNEVA et al., 2006). Acredita- se que o miR-181a inibe a expressão de Hox-A11, tido como repressor do MyoD, necessário para o crescimento muscular (NAGUIBNEVA et al., 2006). Safdar et al. (2009) observaram um aumento no miR-181a 3h após uma sessão de exercício em camundongos e sugeriram que esse miRNA pode promover regeneração muscular ao regular repressores da miogênese (SAFDAR et al., 2009). A relação entre o miR-181c e regeneração muscular e exercício não foi relatada até então. Entretanto, um estudo mostrou que o miR-181c é enriquecido em