Le phage 2972 et 2972 RBP Courte

Plusieurs méthodes sont nécessaires pour une caractérisation exhaustive des interactions entre un phage et son hôte. Pour comparer les phages mutants obtenus lors de cette étude, il faut aussi bien connaître le phage sauvage. Le phage 2972 et le mutant spontané 2972 RBP courte ont été d’abord analysés. Le phage 2972 possède une taille de la progéniture de 120 ± 22 virions relâchés par cellule suite à un cycle infectieux et un temps de latence de 53 ± 1,5 minutes pour compléter ce cycle (tableau 3.5). Le pourcentage d’adsorption après 10 minutes est de 96,4 ± 4,3% des particules virales totales. Les mesures prises en microscopie électronique à transmission révèlent que la queue a une longueur de 256 ± 8 nm et la capside à une largeur de 69 ± 3 nm. Ces données s’approchent de celles publiées dans la littérature, où selon Deveau et al. 2008, le phage 2972 possède une taille de la progéniture de 190 ± 33 virions infectieux par cellule suite à un cycle lytique de 40 ± 3 minutes (1). De plus, le pourcentage d’adsorption expérimental est légèrement plus élevé lors de ces recherches, comparé au pourcentage d’adsorption après 10 minutes de 89,3 ± 2,6%. Finalement, les mesures prises en microscopie électronique à transmission sont semblables à celle de Lévesque et al. 2005,où le phage 2972 possède une capside ayant un diamètre de 55 nm et une queue d’une longueur de 260 nm (26).

Puis, la spectrométrie de masse a permis d’identifier et de confirmer le rôle structural de certaines protéines du phage 2972. Plusieurs protéines qui font normalement partie de la structure du virus n’ont pas pu être identifiées, par exemple la protéine codée par l’orf17 qui code pour une protéine de la queue. La spectrométrie de masse est une technique efficace pour identifier les peptides purifiés, cependant ce système est moins précis lorsque l’on désire détecter les empreintes peptidiques des mélanges de protéines complexes. De plus, le ratio de chaque protéine est différent dans l’échantillon et une quantité trop faible d’une certaine protéine par rapport aux autres peut la rendre non détectable (174). Cependant, deux protéines non détectées lors de cette expérience (ORFS 22 et 23) ont toutefois

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été détectées par Young et al. 2012 en utilisant un système de séparation par gel 2D couplé au LC- MS/MS et donc il est fort probable que la technique utilisée et les paramètres de l’expérience soient sujets à une optimisation (97). Ensuite, certains peptides appartenant à des protéines non structurales ont aussi été détectés (voir section en doré du tableau 3.8), soit les protéines codées par l’orf24, l’orf25, l’orf26, l’orf36 et l’orf42. Cinq peptides uniques ont été identifiés pour l’ORF24, ce qui signifie probablement que cette protéine joue un rôle structural ou elle se retrouve en assez grande quantité sous forme de contamination après la purification du lysat de phage. C’est le cas pour les protéines des orfs 25 et 26 qui codent pour la holine et l’endolysine respectivement, les deux protéines majeures du complexe responsable de la lyse bactérienne. Comme le rôle de ces protéines est connu et qu’il est fort peu probable qu’elles soient associées à la structure, il est juste de proposer qu’elles soient des contaminants suite au processus de purification des phages. Finalement, l’ORF36 et l’ORF42 ont aussi été détectés, toutefois un seul peptide unique a été identifié pour chacune de ces protéines et donc ils ne sont pas considérés dans l’analyse (il en va de même pour l’ORF25). En effet, lorsqu’un seul peptide unique est assigné à une protéine il est impossible de confirmer sa présence dans le mélange protéique.

Pour ce qui est du phage 2972 RBP courte, sa courbe de croissance ressemble à celle du phage 2972, toutefois, le temps de latence est moins long (figure 3.2). En effet, le temps de latence du phage 2972 RBP courte est de 44 ± 4,7 minutes et celle de la taille de la progéniture est de 123 ± 45 comparé à un temps de latence de 53 ± 1,5 minutes et à une taille de la progéniture de 120 ± 22 pour le phage 2972 (tableau 3.5). Le phage 2972 RBP Courte libère donc le même nombre de virions que le phage 2972 suite à la lyse cellulaire, seulement il le fait en prenant environ 10 minutes de moins. La protéine de la RBP joue un rôle dans la première étape de l’infection par un phage, interagissant avec le récepteur à la surface cellulaire lors de l’adsorption (175). Alors, il se peut qu’une mutation dans ce gène soit favorable à une meilleure adsorption, donc un test d’adsorption a été effectué. Toutefois, l’adsorption ne semble pas supérieure à celle du phage sauvage après 10 minutes, ou même après 5 minutes (tableau 3.6). En effet, le phage 2972 RBP Courte a un pourcentage d’adsorption de 92,4 ± 1,4% après 5 minutes et de 89,6 ± 10,4% après 10 minutes et le phage 2972 a un pourcentage d’adsorption de 96,6 ± 0,9% après 5 minutes et de 96,4 ± 2,4% après 10 minutes. Donc, la version plus courte de la RBP ne modifie pas l’efficacité d’adsorption du phage. Toutefois, une mutation spontanée de la RBP pourrait jouer un autre rôle selon Binetti et al. (175). L’adsorption des particules virales ne nécessite pas d’ajout d’ion calcium, mais cet ion est indispensable au processus d’infection (175). Donc, il se pourrait que le phage 2972 RBP courte ne nécessite pas d’ajout de CaCl2 pour

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compléter son cycle infectieux, qui serait ainsi plus rapide et donc aurait un temps de latence plus court.

4.2.2 Le phage 2972Δ22

Le phage 2972Δ22 a été amplement caractérisé. Premièrement, son cycle lytique a une durée de 37 ± 1,0 minutes pour un nombre plus grand que 63 phages relargués par cellule. Le cycle lytique du phage 2972Δ22 est significativement plus court que celui du phage 2972 sauvage. Suite, au séquençage Illumina, une version courte de la RBP a été identifiée et comme le cycle lytique du phage 2972 RBP Courte est aussi plus petit, il est possible que ce soit pour cette raison. Cependant, le temps de latence est tout de même un peu plus court que celui du phage ayant la même version de la RBP, ainsi il se peut que l’orf22 influence la durée du cycle lytique. De plus, une taille de la progéniture précise a été impossible à établir, car le titre du phage augmente de plus en plus après la première lyse au lieu d’être stable sous forme de plateau, comme il est possible d’observer pour une courbe de croissance standard (figure 2.3). Ensuite, une deuxième lyse n’est pas observée dans un temps donné de 112 minutes, alors que normalement lorsque la deuxième lyse cellulaire survient à 74 minutes (données non présentées). Conséquemment, une délétion dans l’orf22 affecte le cycle lytique du phage de façon considérable.

En fonction de sa position dans le génome, il est possible d’émettre plusieurs hypothèses quant au rôle de l’orf22. Il se situe directement après l’orf21 qui code pour la protéine formant la plaque basale et avant le complexe de lyse cellulaire formé par les orfs 25 et 26/29. Les orfs 23 et 24 ont une fonction inconnue. Donc, il est possible que l’orf22 joue un rôle structural, car les modules des phages ont tendance à être regroupés dans les génomes, ou alors il peut aussi jouer le rôle de régulateur de la lyse. Toutefois, il est important aussi de considérer le fait que la fonction de cette protéine pourrait être totalement nouvelle, car les génomes des phages sont parmi les plus diversifiés (176). Pour savoir si l’orf22 prend part dans la structure du phage, une observation en microscopie électronique à transmission a été faite (figure 3.3). L’apparence générale du phage 2972Δ22 et les dimensions calculées ne semblent pas différentes de celle du phage 2972. Le phage 2972Δ22 possède une capside d’un diamètre de 63 ± 4 nm et une queue d’une longueur de 266 ± 6 nm, ce qui n’est pas significativement divergent du phage sauvage qui possède une capside de 69 ± 3 nm et une queue de 256 ± 8 nm. De plus, il n’a pas été détecté en spectrométrie de masse (tableau 3.8), mais si la protéine est en très faible quantité elle ne sera pas identifiée par cette méthode. Par contre, il se peut qu’elle affecte la structure sans pour autant en faire partie, comme par exemple les protéines chaperonnes qui

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aident les autres protéines à maturer jusqu’à leur conformation finale (52). Donc si la structure de la queue ou de la plaque basale est affectée, il se peut que l’adsorption soit affectée. C’est effectivement le cas pour le phage 2972Δ22 qui a un pourcentage d’adsorption de 72,6 ± 5,1% après 10 minutes (tableau 3.6) et donc l’adsorption de ce phage est moins efficace que le phage sauvage qui a un pourcentage d’adsorption proche de 100%. Toutefois, il ne faut pas oublier que le phage 2972Δ22 possède d’autres mutations dans son génome et que les résultats peuvent être dus à ces mutations.

Finalement, une partie des interactions phage-hôte a été caractérisée par la production de BIM. Le nombre de BIM produits avec la souche DGCC7710 contre les phages 2972 et 2972Δ22 est assez similaire, soit respectivement 90,7 ± 20,2 colonies et 61,3 ± 24,5 colonies (tableau 3.9). Ces BIM sont considérés comme des mutants résistants de première génération. Ceci indique que l’absence de l’orf22 n’influence pas le nombre de BIM générés, toutefois le CEM22, qui possède une mutation ponctuelle dans l’orf22 (voir tableau 2.1), semble avoir une production réduite. La mutation ponctuelle change un acide aminé glutamate pour un aspartate, où les deux molécules sont chargées négativement et donc la structure de la protéine codée par l’orf22 ne devrait pas être modifiée (4). En revanche, il est impossible de confirmer cette hypothèse sans avoir la structure des deux protéines (sauvage et le mutant du CEM22), et ainsi il se peut que ce changement affecte la protéine, par exemple dans son adsorption, ce qui pourrait expliquer une diminution de la production de BIM, car moins de phages seraient en contact avec les cellules bactériennes. Cependant, cette diminution n’est pas observée lorsque l’orf22 est délété. Il se peut donc que ce changement soit dû à un phénomène différent, comme une mutation compensatoire dans le génome.

Il y a cependant un changement lorsque les BIM sont produits à partir d’un BIM déjà résistant à 2972, le BIM AR1, pour produire des BIM de deuxième génération. Le phage 2972 n’a pas la capacité de produire des BIM dans ce contexte, car le système CRISPR-Cas du BIM AR1 reconnaît le phage et clive son génome, empêchant ainsi le cycle lytique (1). Quant à lui, le phage 2972Δ22, où le proto- espaceur correspondant à l’espaceur acquis dans le BIM AR1 est absent dû à la délétion dans son génome, n’est pas reconnu pas le système CRISPR-Cas et il peut être utilisé pour générer des BIM. Le nombre de BIM produit par le couple 2972Δ22-BIM AR1 est de 72,2 ± 17,6 colonies, ce qui est très proche du nombre obtenu par le couple 2972Δ22-DGCC7710. Ce résultat est attendu, car les BIM générés par les deux couples sont des BIM de première génération, comme le BIM AR1 n’est pas en mesure de se défendre contre le phage 2972Δ22. Le nombre de BIM de deuxième génération produits par le couple CEM22-BIM AR1 est toutefois intéressant. Environ 120,3 ± 37,7 colonies sont générées lorsque le phage CEM22 infecte le BIM AR1 à une grande MOI.

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Ce phénomène est décrit dans la littérature comme étant le priming, ou l’amorçage, du système CRISPR-Cas. Ceci survient lorsqu’un proto-espaceur correspondant partiellement à un espaceur contenu dans le locus CRISPR stimule une acquisition plus rapide et efficace d’espaceurs additionnels (177). Donc, lorsqu’une cellule bactérienne ayant un système CRISPR-Cas actif subit une infection pour la première fois, le système est décrit comme étant naïf. Cette cellule pourra ensuite acquérir un espaceur ciblant ce phage, pour devenir résistante. Puis, le phage va muter son proto-espaceur, le plus souvent par une mutation ponctuelle dans le PAM ou dans la région 3’ du proto-espaceur, pour ne plus être reconnu lors de l’interférence (80). Lorsque la cellule ayant le nouvel espaceur sera infectée par le phage muté, ce sera donc un système décrit comme primed, ou amorcé (177). Donc, lorsque le CEM22 infecte le BIM AR1, il y a une reconnaissance partielle entre l’espaceur et le proto-espaceur, ce qui active l’acquisition de façon supérieure.

Ce phénomène a majoritairement été observé avec les systèmes CRISPR-Cas de type I, sous-types B, C, E et F (104, 178–181). Il peut être observé par une augmentation considérable des évènements d’acquisition entre la première et la deuxième infection. Par exemple, selon Datsenko et al. 2012, environ 4,3% des colonies résistantes ont acquis un espaceur lors de la première infection et 77% des colonies résistantes ont acquis un nouvel espaceur lors de la deuxième infection. Ceci représente une augmentation du nombre d’évènements d’acquisition d’environ 17 fois (104). Selon le graphique de la figure 3.4 qui montre les ratios des évènements d’acquisitions par rapport au système sauvage, le nombre d’évènements pour le CEM22 augmente de moins de 1,5 fois par rapport au système naïf, représenté par la ligne noire à la valeur de 1. Cependant, si le CEM22 produit moins de BIM que le système sauvage, il est important de comparer la production des BIM de première et de deuxième génération entre eux. Donc, le CEM22 lorsqu’il infecte DGCC7710, produit environ 11,8 colonies résistantes et il produit environ 120,3 colonies résistantes lorsqu’il infecte le BIM AR1, ce qui représente une augmentation d’un peu plus de 10 fois. Cette valeur est assez rapprochée du nombre retrouvé dans la littérature et donc il est possible que le système CRISPR-Cas de type II-A puisse être un système capable d’amorçage.

Les évènements d’acquisition d’un système amorcé ne sont toutefois pas aléatoires et il semble y avoir un motif d’acquisition particulier (182). En effet, les BIM de deuxième génération ont un motif d’acquisition dépendant de l’orientation de l’espaceur, où la majorité des espaceurs acquis se retrouvent sur le même brin d’ADN et donc dans la même orientation, à un pourcentage variant entre 64 % et 83 % (104, 178, 179). Certaines recherches ont de plus démontré que les espaceurs acquis

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étaient regroupés autour de l’espaceur responsable de l’amorçage (180). Selon la figure 3.6-A qui montre la distribution des proto-espaceurs pour l’orf22, il est possible d’observer qu’effectivement la majorité des proto-espaceurs visés se retrouvent sur le même brin que le premier proto-espaceur (brin positif), à un pourcentage de 80% chez le phage CEM22 qui infecte le BIM AR1. De plus, la distribution des proto-espaceurs légèrement regroupée vers la fin du génome, mais sans aucune concentration évidente autour de l’espaceur servant à l’amorçage. Par la distribution des proto- espaceurs majoritairement sur le même brin, il serait possible d’émettre l’hypothèse que le système CRISPR-Cas de type II-A est un système capable d’amorçage de façon brin-dépendant. Toutefois selon la figure 3.6-A il ne semble pas avoir de différence entre le système naïf, soit le phage 2972Δ22 infectant le BIM AR1 et le système amorcé, où la majorité des espaceurs sont aussi sur le même brin à 84,6% et réunis vers la fin du génome. Donc, il se peut que les observations faites pour le système amorcé soient dues à un biais naturel du système CRISPR-Cas de type II-A et non à sa capacité d’amorçage. Pour confirmer cette hypothèse, il faudrait donc répéter l’expérience avec un proto- espaceur situé sur le brin négatif et un proto-espaceur situé au début du génome.

4.2.3 Le phage 2972Δ24

L’orf24 est le seul gène inconnu à l’étude dont la protéine déduite a été détectée par la spectrométrie de masse avec certitude. Il est donc fort probable qu’elle joue un rôle structural dans le génome du phage 2972. Tout comme l’orf22, le gène de l’orf24 se situe à la fin du module des gènes codant pour les différentes protéines de la queue et il se peut que la protéine codée par ce gène soit impliquée dans le complexe de la plaque basale. Toutefois, il se situe proche du gène de l’endolysine qui est très souvent détectée dû à sa très grande expression lors de la lyse. L’endolysine se retrouve souvent sous forme de contaminant et donc il se peut que cette situation s’applique à l’ORF24. Pour déterminer si 2972Δ24 joue un rôle structural, il faudrait l’observer en microscopie électronique et tester l’adsorption.

4.2.4 Les phages 2972Δ27 et 2972Δ28

Les orfs 27 et 28 sont tous deux des gènes situés sur un intron de groupe I sous-groupe A2 entre l’orf26 et l’orf29 qui codent pour l’endolysine. Cette protéine fait partie du processus de lyse bactérienne où elle dégrade le peptidoglycane pour libérer les virions nouvellement formés suite à un cycle lytique (14).

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Les introns appartenant au groupe I sont fréquents chez les phages infectant les bactéries à Gram positif, notamment Lactococcus, Lactobacillus, Staphylococcus et Streptococcus (183, 184). Environ 50% des phages de Streptococcus possèdent un intron de groupe I situé dans le gène de l’endolysine qui se trouve à avoir plusieurs variations du même intron en fonction du phage (185). Chez le phage Sfi21, l’intron qui interrompt le gène pour l’endolysine contient trois cadres de lecture ouverts orientés dans le même sens codant pour trois protéines putatives de 207, 253 et 75 acides aminés. Les domaines des protéines ORF207 et ORF75, nommées par leur nombre d’acides aminés, ont pu être déduits par leur homologie de séquence avec le phage Dp-1 (186). L’ORF207 possède un domaine d’activité catalytique et l’ORF75 possède un domaine de reconnaissance du substrat caractéristique des endolysines de bactériophages. Cet intron a pu être identifié, car le pourcentage en G+C de l’orf253 est considérablement plus faible, à 28%, que le reste du génome du phage qui varie entre 41% et 43%. Il a été démontré que le phage 2972, selon Lévesque et al. 2005, possède le même intron (26). Il est donc intéressant, lors de l’analyse, de remarquer que le pourcentage en contenu G+C de l’orf28 a une valeur d’exactement 28% (données non présentées). Cependant, le produit de ce gène dispose d’une longueur de 61 acides aminés et non de 253. Par contre, l’orf253 semble être un hotspot pour les mutations, car toutes les versions de l’intron possèdent une grande variabilité dans ce gène et ce à partir du codon 55 et l’orf28 est en tout point identique à l’orf253 jusqu’au codon 55, où quelques mutations ponctuelles font de l’orf28 du phage 2972 une version courte de l’orf253 du phage Sfi21 (185).

Finalement, l’ORF253 possède une similitude de séquence avec les endonucléases de type HNH. Toutefois, les recherches de prédiction de motifs en utilisant l’outil HHPred (187) identifient un domaine Ecl1 qui est impliqué dans la régulation du cycle de vie chez Saccharomyces cerevisiae à une probabilité de 94,21%. Une protéine contenant ce domaine, lorsqu’elle est surexprimée, augmente le temps de vie chez la souche en question et donc cela suggère que l’ORF28 du phage 2972 pourrait jouer un rôle de régulation quelconque (188). Pour ce qui est de l’orf27, l’alignement de l’outil HHPred l’associe à NucB, qui est une endonucléase de Bacillus licheniformis responsable de la dégradation du biofilm (189). Cependant, la probabilité de cet alignement est de 65,44% et donc assez faible. Une piste quant à la fonction de l’ORF27 reste donc inconnue.

4.2.5 Le phage 2972Δ36

Le phage 2972Δ36 n’a pas pu être caractérisé lors de ce projet. L’orf36 fait partie des gènes conservés parmi les phages infectants S. thermophilus de type pac et la protéine putative que ce gène encode

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possède un domaine identifié chez plusieurs protéines de phages nommées DUF669. Malheureusement, l’abréviation DUF tient pour Domain of Unknown Function et donc le domaine est identifié chez plusieurs protéines sans pour autant en connaître la fonction. Il serait donc intéressant de trouver la fonction de cette protéine et son rôle dans le cycle infectieux, car ceci permettrait de trouver la fonction des autres protéines possédant ce domaine.