Phénotypage des paramètres de croissance des mutants du métabolisme du mannitol 51

Les paramètres de croissance des mutants du métabolisme du mannitol ont été étudiés par néphélométrie. La néphélométrie est un outil récemment mis au point au sein du laboratoire CFN (voir matériels et méthode) permettant la mesure de la croissance de champignons filamenteux en temps réel en microplaque dans un volume de 300 μl. Une cinétique de mesures sur 24h aboutit à l’obtention d’une courbe de croissance représentative des premières étapes du développement du champignon, de la germination jusqu’à la ramification des jeunes hyphes. L’unité néphélométrique (RNU) est proportionnelle au poids sec d’A. brassicicola. Plusieurs paramètres issus de l’analyse de la courbe de croissance nous renseignent sur l’impact d’une mutation ou l’activité d’un composé.

La durée de la phase de latence (ou lag-time) est l’un de ces paramètres. Elle est définie par le temps mis avant d’atteindre une vitesse de croissance préalablement déterminée. Elle informe ainsi sur la période de latence avant la germination ou encore sur la viabilité des conidies. La pente maximale de la courbe est un autre des paramètres issus des courbes de croissance. Il renseigne sur la vitesse de croissance maximale (VM) du champignon. Des deltas de lag-time ou de VM sont calculés entre la condition testée et la condition de référence. L’aire sous la courbe, avant que cette dernière n’atteigne la saturation peut également être calculée. La comparaison des aires de la

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d’A. brassicicola ⁵²

condition témoin avec celles de la condition d’interet permet d’exprimer les résultats en pourcentage d’inhibition de croissance. Ces indices permettent d’évaluer l’impact d’une mutation et, ou la réponse à divers stimuli.

La figure 26 illustre les courbes de croissance des différents génotypes obtenues par

néphélométrie dans le milieu PDB. Dans ces conditions, les compositions glucidiques intracellulaires différentes pour chaque génotype influencent la germination ainsi que l’élongation des hyphes ou leur ramification. Cependant les différences enregistrées ne sont pas significatives (au seuil de 1% avec un test de Student) sauf chez les mutants Ab∆mdh1où La perte de l’enzyme retarde le temps moyen de germination des mutants de presque 3h.

1.8.Réponses des mutants du métabolisme du mannitol aux stress oxydatifs

Plusieurs études sur le mannitol démontrent ses propriétés anti-oxydantes in vivo et in vitro : elles ont contribué à élaborer l’hypothèse que ce polyol pouvait intervenir dans la tolérance au stress oxydatif généré par les plantes lors d’une infection. Nous disposons avec les trois mutants du métabolisme du mannitol d’outils biologiques pour tester cette hypothèse.

 Etude du potentiel anti-oxydant

La perte d’une ou des deux voies métaboliques du mannitol entraîne une modification de la proportion de sucres solubles accumulés par A. brassicicola. Les différents génotypes sont cultivés en milieu liquide (Vogel 2% glucoses, 24°C, 150 rpm) pendant sept jours. Le potentiel anti-oxydant des sucres solubles totaux contenus dans les extraits des différentes colonies d’A. brassicicola a été évalué par un test DPPH (figure 27). Seuls les extraits de sucres solubles issus du mycélium des mutants Ab∆mpd1∆mdh1 présentent un potentiel antioxydant plus faible que celui retrouvé chez les extraits issus du génotype sauvage. Le DPPH° (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl) est un radical stable R° à température ambiante de couleur bleue intense. La mesure de l’efficacité d’un antioxydant (capacité à fixer des radiaux libres) se fait en mesurant la décoloration (violet jaune) due à la réduction de DPPH° par les composés antioxydants putatifs. La perte d’une seule voie du métabolisme du mannitol ne semble pas altérer de façon significative la capacité à fixer les radicaux libres des extraits de sucres solubles. Cependant le test DPPH ne permet pas d’évaluer le potentiel antioxydant contre des molécules comme H2O2 qui est notamment rencontrée par le champignon lors de l’interaction. Pour définir si le mannitol joue un rôle clef dans la protection contre les FAO d’autres tests de pouvoir antioxydant sont à envisager sur les extraits de sucres solubles des différents génotypes. Par exemple un test de type ORAC (Oxygen radical absorption capacity) ou AARS (Activité antiradicalaire

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superoxyde O2^•-) pourront être menés. Les résultats seraient alors plus représentatifs de l’activité antiradicalaire des extraits de sucres.

 Etude de la réponse au stress oxydatif généré par l’H2O2

Au cours de l’interaction avec la plante hôte, le stress oxydatif peut notamment être provoqué par une augmentation drastique de la concentration en H2O2 au point d’infection. Pour étudier l’implication potentielle du métabolisme du mannitol dans la réponse adaptative à ce type de stress, la sensibilité des mutants a été testée par néphélométrie en effectuant des mesures de croissance en présence d’H2O2 à différentes concentrations (figure 28). Une différence significative de sensibilité à l’H2O2 des mutants est révélée par cette étude. Les trois mutants sont moins tolérants à l’H2O2 que le génotype sauvage Ab43wt. De façon étonnante, les doubles mutants Ab∆mpd1∆mdh1 semblent légèrement moins sensibles que les deux simples mutants Ab∆mpd1 et Ab∆mdh1.

 Etude de la réponse au stress oxydatif généré par les isothiocyanates

L’analyse néphélométrique de la croissance des mutants du métabolisme du mannitol en présence d’Al-ITC a été réalisée pour mesurer la sensibilité à ce type de stress oxydatif intracellulaire. La tolérance aux ITC est significativement différente selon les génotypes testés.À des concentrations tolérées par le génotype sauvage, notamment 5 mM d’Al-ITC, les souches Ab∆mpd1 et Ab∆mpd1∆mdh1 sont sensibles (figure 29). Les souches Ab∆mdh1 présentent une tolérance similaire à la souche de référence Ab43wt. La sensibilité des simples mutants Ab∆mpd1 et celle des doubles mutants s’observe également à de plus faibles concentrations (2,5 mM). Leur temps de latence est plus élevé que celui des souches plus tolérantes comme Ab43wt et Ab∆mdh1. Les concentrations en ITC in planta sont difficiles à estimer étant donné qu’ils sont issus de la dégradation des glucosinolates au point d’infection. Toutefois il a été montré chez A.thaliana que certaines cellules contiennent environ 100 mM de glucosinolates. Sachant qu’environ 8% des glucosinolates sont dégradés en ITC, les concentrations inhibitrices identifiées dans notre étude sont donc compatibles avec celles potentiellement existantes in planta (Halkier and Gershenzon, 2006).

L’exposition des mutants du métabolisme du mannitol aux Al-ITC semble indiquer que la réponse adaptative pourrait être liée à la voie MPD dépendante. Pour déterminer si ces mécanismes de protection impliquent une remobilisation des sucres vers la neosynthèse de mannitol, ce polyol a été dosé dans le mycélium du champignon suite à l’exposition à une dose sub-létale (1mM) d’Al-ITC

(figure 30). Dans ces conditions, l’exposition aux Al-ITC ne modifie pas significativement les contenus

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d’A. brassicicola ⁵⁴

une légère augmentation du polyol est à noter chez le génotype sauvage. Cette tendance à l’accumulation est cohérente avec la surpression du gène Abmpd1 lors d’une cinétique d’exposition aux Al-ITC (figure 31). Chez les mutants délétés dans ce gène, la néosynthèse de mannitol dans les hyphes en réponse à ce stress est impossible, entrainant probablement une sensibilité accrue aux dérivés des glucosinolates. L’expression du gène Abmdh1 est quand à elle plutôt réprimée dès perception des Al-ITC (30 minutes). Même si au cours du temps le niveau de transcripts augmente, son expression ne dépasse jamais celle observée en condition témoin.

 Etude de la réponse au stress oxydatif généré par la ménadione

Un stress oxydatif intracellulaire peut également être généré in vitro par divers composés comme par exemple la ménadione. Les résultats de sensibilité aux Al-ITC des mutants ont été confrontés à ceux obtenus avec ce composé de référence selon la même méthodologie (figure 32). Les profils des quatre génotypes traités avec de la ménadione est cohérent avec ceux obtenus lors des tests de sensibilité aux Al-ITC: les mutants Ab∆mpd1 etAb∆mpd1∆mdh1 sont significativement plus sensibles que le génotype sauvage. Le phénotype de sensibilité à la ménadione des mutants Ab∆mdh1 est très proche de celui du génotype sauvage.