Caractérisation phénotypique

 Dosage de l’activité des enzymes MPD et MDH

Le mycélium issu d’une culture liquide (PDB, 24°C, 150rpm) est récolté après 3 jours d’incubation par filtration puis lavé avec une solution de Tris (50mM pH 7,5). L’extraction de protéine totale se fait par broyage du mycélium lyophilisé dans 5ml de tampon d’extraction (Tris 50mM pH 7,5 DTT 5mM) par gramme de matière sèche. L’extrait est centrifugé à 20 000 g pendant 5 min à 4°C. Le surnageant est transféré dans un nouveau microtube et placé à 4°C. La quantité de protéines totales de l’extrait est dosée au Nanodrop ND-1000 (Labtech international). L’activité de l’enzyme est évaluée par la lecture de l’absorbance à 340 nm toutes les 2 min pendant 20 min d’une solution réactionnelle spécifique à chaque enzyme. La solution réactionnelle pour mesurer l’activité de la MDH à lieu dans 1 ml. Elle est composée de 200 µl de tampon de dosage (Tris 100 mM pH 7,5) en présence de 10 µl d’extrait de protéines, 100 µl de co-facteur NADPH 2mM et 100 µl de substrat, du fructose à 8M. Pour mesurer l’activité de la MPD, le volume réactionnel est également de 1 ml, il se compose de 500µL de tampon de dosage (Tris 100 mM pH 7,5) en présence de 50 µl d’extrait de

| Matériel et méthodes 104 protéines. Le co-facteur employé est le NADH 2 mM (100µl) et le substrat de l’enzyme est le Fructose-6-phosphate à 250 mM (100 µl). La réduction des cofacteurs (NADPH/H⁺ ou NADH/H⁺) par les extraits de protéines totales des différents génotypes est mesurée après ajout dans le volume réactionnel des substrats des enzymes MDH (fructose) ou MPD (fructose-6-phosphate) comme décrit dans la publication de Jennings et al. (2006)

 Dosage de l’activité de conjugaison au glutathion des enzymes GST

L’activité GSH-transférase a été évaluée sur les extraits totaux protéiques des différents génotypes d’A. brassicicola. 50µl d’extrait protéique est mélangé à 1ml du tampon contenant 1mM CDNB, 1mM GSH et 0.11M de phosphate de sodium pH 6.5 et l’ensemble est incubé à température ambiante pendant 5 min. La formation du complexe GS-CDNB est suivie par mesure de l’absorbance à 340nm et l’activité transférase a été calculée comme étant le nombre de mole de CDNB conjugué par mg de protéine par minute.

L’activité transférase vis-à-vis des Al-ITC a été déterminée en suivant le protocole décrit par Sellam (2007). 50µl d’extrait protéique est mélangé à 1ml du tampon contenant 20µM d’Al-ITC, 1mM GSH et 40mM de phosphate de sodium pH 8.5 et l’ensemble est incubé à température ambiante pendant 6 min. La formation du complexe GS-ITC est suivie par mesure de l’absorbance à 274nm et l’activité transférase a été calculée comme étant le nombre de mole de l’AlITC conjugué par mg de protéine par minute.

 Analyse de croissance fongique par turbidimétrie

La néphélométrie a été utilisée pour mesurer la croissance fongique dès les premiers stades du développement fongique: la germination de la conidie, l'élongation et la ramification des hyphes. C'est une technique de mesure du trouble qui prend en compte les particules dans la totalité du milieu de culture. Un récepteur comptabilise les rayons laser déviés et les traduit en RNU, unité arbitraire néphélométrique, proportionnelle à la concentration en particule du soluté. Une analyse cinétique de la croissance fongique sur 33h permet d'obtenir une courbe de croissance représentative du développement du champignon. Les analyses sont effectuées sur une microplaque de 96 puits (Greiner). 300 µl de PDB supplémenté selon l'étude sont inoculés avec des conidies âgées de 15 jours maximum. La culture se fait à 24°C sous agitation 175 rpm pendant 5 min puis au repos les 5 min suivantes. Les mesures sont prises toutes les 10 min, après agitation. Une matrice de traitement des résultats a été construite sous Excel pour normaliser les données brutes et les traduire en graphique. Cette technique innovante mise au point au cours de cette thèse a fait l’objet

| Matériel et méthodes 105 d’une publication : Joubert, Calmes et al., (2010). Cet article est disponible dans son intégralité au point 7 (page ) du matériel et méthode.

 _{Utilisation de l’outil népéhlométrique pour évaluer le taux de contamination}

fongique d’une graine

Pour un pathogène transmissible par les semences, sa conservation sur le tégument de la graine est une condition sine qua none pour la réalisation de son cycle parasitaire. Lors de leur maturation les semences transitent par une phase importante de dessiccation qui peut abaisser le potentiel hydrique à sa surface jusqu’à -1,7 MPa. Les conidies présentent doivent survivre à ce stress abiotique et garder leur capacité germinatives pour pouvoir amorcer un nouveau cycle. Jusqu'alors il n’existait pas de moyen technique pour évaluer le taux de conidies vivantes présentes sur les semences. Parmi les tests existants, le plus fréquent consiste à déposer des graines potentiellement contaminées sur un milieu de culture et définir un pourcentage de graines qui développent une colonie mycélienne. Pour évaluer la fiabilité de ce test, des lots de graines de radis préalablement désinfectées ont été inoculés in vitro avec une gamme suspensions de conidies d’A. brassicicola

(génotype sauvage). 30 graines sont immergées dans une suspension de 5 ml de conidies pendant 30 min. La suspension est ensuite retirée et le lot de graine est mis à sécher 1h sous hôte. Les graines sont ensuite disposées par lot de dix sur boîte de Petri (eau gélosée 2% d’agar, 2% glucose). Après 1 semaine d’incubation à 24°C à l’obscurité, l’apparition de colonies fongiques est observée (figure 80). Aucun développement de colonie fongique n’est visible à partir des graines non inoculées. La désinfection au NaOCL est efficace. En revanche 100% des graines inoculées, indépendamment de la concentration en conidies, présentent un développement de colonie d’A. brassicicola. La seules différence notable est l’absence de germination pour 2 des 20 graines inoculées avec une suspension à 10⁵ c/ml. Ce type de test ne nous permet donc pas d’évaluer un taux de contamination sur une graine.

Un protocole néphélométrique a été adapté afin de lire une cinétique de croissance fongique issue d’une graine inoculée (figure 81). Une graine par puits est déposée sur une plaque Greiner® 96 puits. 300 µl de PDB est ajouté à chaque puits. La plaque est placée dans le néphélomètre suivant un protocole standard sans agitation (25°C, 175 rpm, 90 de gain, 20% d’amplitude). Le lag-time de la courbe de croissance fongique obtenue est représentative de la population de conidies vivante présente à la surface de la graine (tableau 7). Les semences de radis issues des mêmes lots artificiellement inoculés ayant servis pour les tests en boîte de Pétri ont été analysées par néphélométrie.

| Matériel et méthodes 106 Le log de la concentration en conidie en fonction du lag-time peut être tracé. Le lag-time est proportionnel au taux de conidies présent sur la graine avec un R² de 0.94. Cependant il s’agit là d’un test préliminaire et l’analyse d’une gamme de contamination des graines plus large et plus précise permettrai de d’augmenter ce pourcentage de corélation. L’analyse néphélométrique permet donc d’évaluer le taux d’infection sur une graine. Les lag-times semblent représentatifs du nombre de conidies vivantes présentes à la surface des semences. Ce protocole peut être appliqué à la mesure de la conservation de conidies sur graines.

 Analyse de croissance fongique par mesure de la croissance radiale

Les solutions contenant les différents composés testés sont incorporées au milieu PDA encore en fusion et le mélange est coulé dans des boîtes de Petri. Pour chaque test, trois répétitions par génotypes et par conditions sont réalisées. A partir d’une culture fongique âgée d’une semaine, des disques mycéliens de 8 mm de diamètre sont prélevés et déposés au milieu de chaque boîte de culture supplémentée ou non. La croissance mycélienne a été évaluée au bout de 10 à 15 jours d’incubation à 24°C par mesure du diamètre de la colonie fongique.

 Génération d’un stress matriciel en boîte de Petri avec du PEG

Du milieu Vogel est préparé sans ajout de sucre et additionné de tampon MES (1,2 g/l). Le pH est ajusté à 5,7 puis la solution est complémenté avec 15 g/l d’Agar. Après autoclavage, 20 ml de milieu exactement sont coulé dans des boîtes de Pétri de 9 cm de diamètre. A nouveau du milieu Vogel est préparé (sans sucre ajouté, MES à 1,2 g/l, 15 g/l d’Agar, pH 5,7) et autoclavé. Le PEG est ajouté au milieu en surfusion : 0 g pour un potentiel hydrique final de 0,25 MPa ; 400 mg pour -0,7 MPa ; 700 mg pour -1,7 MPa. Le milieu gélosé préalablement coulé et séché est recouvert de 30 ml de solution liquide PEG, les boîtes sont recouverte et le PEG est laisser à infuser dans l’agar toute une nuit. Le lendemain le surplus de solution est éliminé. Les inoculum peuvent alors y être déposer pour réaliser un test de sensibilité au stress matriciel.

 Déterminisme du pouvoir pathogène

A partir de cultures d’A. brassicicola âgées de 7 jours, une suspension de conidies calibrées est préparée dans de l’eau stérile. Les feuilles des plantes de B. oleracea ou A. thaliana, au stade 4 à 6 feuilles vraies sont inoculées par dépôt de 5 μl de la solution de conidies. Après l’inoculation, les plantes sont conservées à l’intérieur des enceintes climatiques dans les mêmes conditions de croissance que les plantes saines avec une humidité relative saturante. L’obscurité est maintenue pendant 48 heures après l’inoculation. Les symptômes sont appréciés par mesure du diamètre de la nécrose ou de l'halo chlorotique. La sporulation in planta est évaluée par comptage des conidies

| Matériel et méthodes 107 présentes sur les symptômes. La zone symptomatique est découpée et placée dans un microtube avec 1ml d’H2O stérile à 0.01% de tween 20. Le tube est placé au vortex à puissance maximale pendant 30s et les résidus végétaux sont retirés. Le titre de la suspension de conidies est estimé sous microscope à la cellule de Thoma.

 Coloration au solophényl d’A. brassicicola in planta

Les structures d’A. brassicicola spécifiques à la pénétration des tissus hôtes appelées pseudo-appressoria ont été observée par microscope à fluorescence Leica. Les feuilles de choux inoculée sont décolorée et les structures fongiques sont colorée avec du Solophényl Flavine 7GFE 500 (Ciba Specialy Chemicals, NC) décrit dans la publication de Hoch et al. (2005).