Méthodes d'analyse des acides nucléiques

 Extraction d’ADN génomique

- Méthode de Möller et al. (1992)

300 mg de mycélium sont prélevés en raclant la surface de boîtes de Pétri puis lyophilisés. Le lyophilisat est broyé mécaniquement afin d'obtenir une fine poudre. Le broyat obtenu est transféré dans un tube 1.5 ml et remis en suspension dans 1 ml de méthanol-0,1%-β-mercaptoéthanol. Après agitation, le mélange est centrifugé pendant 5 min et le surnageant est éliminé. Cette étape est répétée 2 fois. Le culot est ensuite séché à température ambiante pendant au moins 1 heure, puis remis en suspension dans 500 µl de TES (Tris 100 mM pH8; EDTA 10 mM; SDS 2%) en présence de 100 µg de protéinase K. Le mélange est incubé à 60°C pendant 1 heure avant l’addition de 140 µl de NaCl 5 M (concentration finale de 1,4 M) et de 65 µl de CTAB 10% (concentration finale de 1%). Après incubation à 65°C pendant 10 min, un volume de chloroforme/alcool isoamylique (24:1) est ajouté. Le mélange est conservé dans la glace pendant 30 min puis centrifugé 10 min à 4°C à 12000 g. La phase aqueuse est mélangée à 0,215 volume d’acétate d’ammonium 7,5 M. Le mélange est incubé dans la glace pendant 30 min puis centrifugé pendant 10 min à 4°C à 12000 g. L’ADN est précipité par addition sur le surnageant de 0,55 volume d’isopropanol froid. Le tube est agité doucement jusqu’à apparition de filaments d’ADN. Ceux-ci sont prélevés à l’aide d’une pipette pasteur et lavés dans 500 µl d’éthanol 70%. L’ADN est séché à l’air libre, remis en suspension dans 50 à 100 µl de TE (Tris-HCl 10 mM pH8 ; EDTA 0,1 mM pH 8,0) contenant de la RNase (0,2mg/ml).

- Méthode d’Edwards et al. (1991)

Cette méthode rapide d’extraction de l’ADN a été utilisée pour extraire à la fois le mélange ADN fongique et ADN végétal des feuilles infectées dans le but d’analyser l’expression de gènes au cours d’une cinétique d’infection. Cinq feuilles infectées sont réduites en poudre fine dans un mortier en présence d’azote liquide. 400µl de tampon d’extraction (200 mM de Tris-HCl pH 7.5, 250 mM de NaCl, 25 mM d’EDTA et 0.5 % de SDS) sont ajoutés au broyat et l’ensemble est mélangé au vortex pendant 5 min. Après une centrifugation d’une minute à 13000 rpm, 300 µl de surnageant sont transférés dans un tube 1.5 ml et l’ADN est précipité avec un volume d’isopropanol. Le culot obtenu après une centrifugation de 5 min à 13000 rpm est repris dans 100 µl de tampon TE 1X.

| Matériel et méthodes 99

- Méthode Goodwinn et Lee (1993)

L’extraction de l’ADN génomique d’A. brassicicola est réalisée par une méthode de lyse cellulaire par micro-ondes.

 Extraction d’ARN totaux

Après un broyage dans l’azote liquide, 100 mg de mycélium en poudre sont placés dans un microtube à centrifuger. Du TRIzol (0,5 ml, Invitrogen) est ajouté et l’ensemble est agité vigoureusement au vortex. Après une incubation de 15 min à température ambiante, le mélange est centrifugé 10 min à 18 000 g. La phase supérieure est prélevé avec précaution, transférée dans un nouveau tube et 0,4 volumes (200 μL) de chloroforme y sont ajoutés. Après une agitation vigoureuse de 30 secondes, l’échantillon est incubé 15 min à température ambiante avant d’être centrifugé 5 min à 18 000 g. La phase aqueuse est transférée dans un nouveau tube et 350 µL d’éthanol 70% sont ajoutés. Après avoir mélangé l’échantillon 3 à 4 fois par retournement, celui-ci est transféré dans une colonne du kit NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel) et centrifugé pendant 30 secondes à 11 000 g. La suite de l’extraction est réalisée selon le protocole du fournisseur. Un µl du volume final est utilisé pour doser les acides nucléiques au spectrophotomètre Nanodrop ND-1000 (Labtech international).

 Préparation des ADNc par reverse transcription (RT)

Les ARN purifiés sont reverse transcrits en ADN complémentaires (ADNc) afin d’être amplifiés par PCR ultérieurement. Avant l’étape de transcription inverse proprement dite, la solution d’ARN est chauffée à 80°C pendant 3 min afin de dénaturer les structures secondaires. Les ARN (5 µg) sont ensuite reverse transcrits pendant 1 heure à 42°C dans un volume de 30 µl comprenant 200 unités de rétrotranscriptase du virus de la leucémie murine Moloney (MMLV rétrotranscriptase, Promega), 400 nM d’amorce oligo(dT)15, 1 µM de random hexamères, en présence de Tris-HCl 50 mM, KCl 75 mM, DTT 10 mM, MgCl2 3 mM et de dNTP 500 µM. 50 unités de RNaseH (Promega) sont ajoutées et les enzymes sont finalement dénaturées par chauffage à 80°C pendant 10 min. La réaction est réalisée dans un thermocycleur (Biorad®) et le produit final est conservé à –20°C.

 Réaction d’amplification spécifique de l’ADN par PCR conventionnelle

La matrice d’ADN ou d’ADNc est amplifiée dans un volume final de 50 μL contenant 200 μM de chacun des quatre désoxyribonucléotides (dNTP, Promega), 400 nM de chaque amorce, 1 unité de GoTaq (Promega,), 10 mM de tampon de réaction (Tris-HCl pH 9,0, 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100 (v/v), 1,5 mM MgCl2). Les conditions d’amplification sont les suivantes : une étape de dénaturation

| Matériel et méthodes 100 initiale à 95°C pendant 3 min suivie de 30 à 35 cycles et d’une étape d’élongation finale à 72°C pendant 15 min. Chaque cycle comprend une étape de dénaturation à 95°C de 30 secondes, une étape d’hybridation des amorces de 50 secondes à température variable selon la nature des amorces, et une étape d’élongation à 72°C pendant un temps variable selon la taille attendue du produit amplifié. Certaines réactions d'amplification nécessitent une grande fidélité notamment lors de l'accumulation de cassette de mutation, dans ce cas les PCR sont réalisées avec une ADN polymérase haute fidélité (Taq Phusion Finnzyme) selon les indications du fournisseur.

 Hydrolyse de l’ADN

L’analyse par restriction de l’ADN nécessite l’utilisation de différentes endonucléases, utilisées à raison de 2 à 5 unités par μg d’ADN et selon les indications du fabricant (Promega).

 Clonage des fragments amplifiés

Le mélange réactionnel de ligation contient 50 à 100 ng d’ADN purifié, 25 ng de vecteur PGeMT, 1,5 unités Weiss d’ADN ligase du bactériophage T4 dans le tampon d’activité (Tris-HCl 30 mM pH 7,8 ; MgCl2 10 mM ; DTT 10 mM ; ATP 1 mM). La ligation s’effectue pendant une nuit à 4°C dans un volume final de 10 μL. Deux microlitres du mélange de ligation sont introduits par choc thermique dans des cellules thermocompétentes d’Escherichia coli JM 109. Les bactéries recombinées sont sélectionnées par étalement et incubation sur un milieu 2YT gélosé (2YT Bacto Peptone 1%, Extrait de levure 1%, NaCl 0,5% ; Agar 1,5% (p/v)) contenant de l’ampicilline à raison de 50 μg/ml et supplémenté de 40 μg de 5 bromo-4chloro-3indoyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) et 100 μg d’isopropyl-β-Dgalactopyranoside (IPTG), afin d’effectuer une sélection de type blanc/bleu. Les colonies blanches (potentiellement recombinantes) sont repiquées en milieu liquide (2YT additionné d’ampicilline à 50 μg/ml) et incubées une nuit à 37°C.

L’extraction et la purification des plasmides sont réalisées à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel) suivant le protocole préconisé par le fournisseur. La méthode de lyse alcaline décrite par Birnboim (1983) est également utilisée en routine.

 Electrophorèse sur gel d'agarose

Les fragments d’ADN obtenus après PCR ou hydrolyse enzymatique sont séparés selon leur taille par électrophorèse dans du tampon TAE 0,5X (Tris-acétate 40 mM, EDTA 1 mM pH 8,0). La migration s’effectue sous une tension de 100 V dans du tampon TAE 0,5X. Le gel est ensuite immergé dans un bain de bromure d’éthidium (BEt) à 0,5 µg/ml pendant 15 min et les fragments amplifiés sont visibles par exposition du gel au rayonnement UV (310 nm).

| Matériel et méthodes 101

 Mesure de l’expression des gènes par RT-PCR quantitative

La technique de PCR quantitative permet de quantifier les fragments d’ADN amplifiés spécifiquement. L’appareil utilisé au laboratoire est l’ABIPrism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). La PCR quantitative est réalisée en plaque de 96 puits dans un volume final de 25 µl. Le mélange réactionnel contient la matrice d’ADNc, 300 nM de chaque amorce et 12,5 µl de SYBR Green PCR Master Mix 2X (Appplied Biosystem). Les conditions de thermocyclage consistent en une étape de 2 min à 50°C, pendant laquelle l’uracile-N-glycosylase est activée de façon à empêcher l’amplification de produits PCR contaminants, une étape de 10 min à 95°C qui permet l’activation de l’ADN polymérase, suivie de 40 cycles d’amplification. Chaque cycle se compose d’une étape de 15 secondes à 95°C suivie d’une étape d’une minute à 60°C.

A la fin de la PCR, une courbe de fusion est obtenue pour chaque amplificon. Il s’agit d’une montée lente de température jusqu’à 95°C, à raison de 0,1°C par seconde, au cours de laquelle la quantité de fluorescence baisse d’une manière brutale. Le rapport des dérivées de la fluorescence et de la température donne un pic correspondant au Tm du produit PCR. Cela permet notamment de discriminer un dimère d’amorces d’une amplification spécifique.

Pour quantifier le facteur d’induction d’un gène en fonction d’une condition donnée, le Ct de sortie doit être normalisé, dans un premier temps, par soustraction avec le Ct d’un gène de référence constitutif (ici, le gène de la tubuline). On obtient un ΔCt que l’on soustrait ensuite au ΔCt du gène étudié, exprimé en condition témoin, obtenant ainsi un ΔΔCt. Le facteur d’induction du gène est donné par application de la formule: 2-(efficacité du couple d’amorces) ΔΔCt (Winer et al., 1999).

| Matériel et méthodes 102