Article I. The Notch Signaling Pathway Controls Short-Lived Effector CD8+ T Cell
3. Rôle de la voie de signalisation Notch dans les LT CD8 lors d’une réponse aiguë
3.1 La voie de signalisation Notch dans la réponse effectrice des LT CD8
3.1.5 Perspectives
3.1.5.1 Mécanistique
Nous avons découvert un rôle essentiel de la voie de signalisation Notch dans la différenciation terminale ainsi que dans l’acquisition des fonctions effectrices des LTe CD8. Concernant son rôle dans l’établissement de la fonctionnalité des cellules T, il est facile d’imaginer que cette voie contrôle directement l’expression des cytokines et des molécules effectrices telles que la granzyme B ou la perforine par fixation directe du NICD à leurs promoteurs tel que cela a déjà été décrit dans d’autres types cellulaires bien que cela soit encore à prouver pour certaines de ces molécules dans les LT CD8. Cependant, son rôle dans le choix de différenciation des LT CD8 reste obscur. En effet, la diminution drastique de la génération de SLEC en absence de la voie Notch ne s’accompagne pas d’une diminution de l’expression des deux facteurs de transcription connus pour être indispensables à ce mécanisme. Cela suggère que cette voie de signalisation induit l’expression d’une protéine encore inconnue et qui serait capitale dans la différenciation terminale des SLEC. Une autre hypothèse implique que le NICD collabore avec d’autres facteurs de transcription tels que T-bet et Blimp-1 pour induire la transcription optimale du programme transcriptionnel SLEC. Ainsi, pour comprendre comment la voie de signalisation Notch contrôle ce choix de différenciation, nous souhaiterions déterminer quelles sont les cibles transcriptionnelles directes et indirectes de la voie de signalisation Notch dans les LT CD8 à des temps précoces de la réponse, avant que ces choix de différenciation ne soient effectués. Pour ce faire, nous allons réaliser le séquençage et la quantification de tous les ARNm (RNA-séq) présents dans les LT CD8 3 jours post-infection pour déterminer le profil transcriptionnel induit par la déficience de la voie de signalisation Notch. Ainsi, il sera possible d’identifier parmi les gènes différentiellement exprimés ceux qui pourraient être impliqués dans la génération des SLEC. Nous avons déterminé que le jour 3 post-infection est cohérent puisque le blocage de la voie Notch par des anticorps bloquant les ligands DLL1 et DLL4 à jour 0 et 3 conduit à une diminution de la génération des SLEC similaires à celle observée dans les LT CD8 D/D tandis qu’un blocage de ces ligands uniquement à jour 3,5 post-infection n’a plus d’effet sur la génération des SLEC (résultats non publiés).
Ainsi, ces résultats suggèrent que la voie Notch agit entre le jour 0 et le jour 3,5 pour induire son effet sur la génération de SLEC. Le rôle de gènes identifiés par le RNA-séq sera testé par surexpression ou invalidation de leur expression dans des LT CD8 activés. Cette expérience permettra aussi d’identifier quelles sont les molécules effectrices, mais aussi quelles sont les voies (métabolique, glycolytique par exemple) qui sont contrôlées par la voie de signalisation. Il sera aussi possible de savoir si la voie de signalisation semble affecter la migration des LT CD8 en déterminant si celle-ci contrôle l’expression de récepteurs aux chimiokines notamment. Une telle expérience de RNA-séq a déjà été effectuée dans des LT CD8 sauvages et déficients pour les récepteurs Notch1 et Notch2 suite à une infection de la grippe chez la souris473. Cependant, ce dernier ayant été réalisé au pic de la réponse, après que les évènements de différenciations aient eu lieu, il ne met en évidence que les conséquences d’un défaut de différenciation en SLEC et non les causes. En effet, cette expérience révèle que plus de 40% des gènes spécifiquement exprimés dans les SLEC sont plus faiblement représentés des LT CD8D/D tandis que 36% des gènes signature des MPEC sont plus fortement exprimés en l’absence de Notch comparé aux LT CD8 sauvages.
Les cibles transcriptionnelles directes de la voie de signalisation Notch pourraient être identifiées par une expérience d’immunoprécipitation de la chromatine à l’aide d’anticorps dirigés contre le NICD et RBPJk suivi du séquençage à haut débit (Chip-séq). Cette expérience sera effectuée à des temps précoces suite à l’activation in vitro des LT CD8 en présence de ligands pour la voie de signalisation Notch. La comparaison des résultats des expériences de RNA-séq et de Chip-séq nous permettra de nous assurer que la liaison du NICD à l’ADN est bien responsable de la régulation transcriptionnelle du gène identifié. Il sera aussi possible de savoir si CD25 est une cible transcriptionnelle directe de Notch. De plus, l’analyse bio- informatique des résultats générés par l’expérience de Chip-séq nous permettra d’identifier la présence de séquences spécifiquement reconnues par d’autres facteurs de transcription aux alentours de celles spécifiques du complexe NICD-RBPJk. Cela permettra d’identifier d’éventuels évènements de collaboration entre le NICD et d’autres FT tels que T-bet et Blimp- 1 pour induire la transcription de gènes cibles. Dans le cas où des séquences consensus spécifiques d’autres FT seraient trouvées proches de celui spécifique au NICD, nous testerons l’effet collaboratif de ces FT en supprimant l’expression de chacun de ces FT individuellement
et simultanément. Nous analyserons aussi l’effet collaboratif sur la transcription à l’aide d’un rapporteur luciférase contenant le fragment de promoteur identifié.
Étant donné que la voie de signalisation Notch influence positivement l’activation de la voie PI3K-Akt-mTOR, nous souhaiterions analyser l’effet de l’absence des récepteurs Notch1 et Notch2 sur le métabolisme des LT CD8473. Dans un premier temps, nous allons vérifier que dans nos modèles d’infection et de vaccination, la voie PI3K-Akt-mTOR est moins activée par cytométrie en flux. Des résultats préliminaires effectués sur des effecteurs à jour 3 post-infection suggèrent une plus faible expression de la forme phosphorylée de la protéine S6, du transporteur d’acides aminés CD98, du transporteur de transferrine CD71 (résultats non publiés).Ensuite, nous souhaitons analyser les conséquences biologiques de la diminution d’activation de cette voie en comparant les taux de consommation d’oxygène (respiration cellulaire) ainsi que le taux d’acidification extracellulaire (glycolyse).
Enfin, la génération des SLEC est influencée par la localisation des LT CD8 au sein de la rate. Or, la déficience de la voie de signalisation Notch dans les LT CD8 impacte la localisation de ces derniers dans la rate puisqu’ils sont en plus grand nombre dans la pulpe blanche. Ainsi, il serait intéressant d’analyser le rôle de la voie Notch sur l’expression de récepteurs aux chimiokines. L’expérience de RNA-séq décrite ci-dessus répondra à cette question.
3.1.5.2 Modalités d’activation de la voie de signalisation Notch
Nous ne savons que peu de choses sur les événements conduisant à l’activation de la voie de signalisation Notch. Néanmoins, l’équipe du Dr Maillard a mis en évidence que, lors d’une réaction du greffon contre l’hôte, les ligands DLL1 et DLL4, exprimés à la surface des cellules stromales des organes lymphoïdes secondaires, sont responsables de l’activation de la voie Notch au sein des cellules T CD4 et CD8533,535,536,557. Leurs études démontrent que Notch n’est pas requis tout au long de la réponse lymphocytaire pour induire son effet lors de la réaction du greffon contre l’hôte532. Au contraire, l’activation de la voie est requise tôt, dans les deux premiers jours, pour affecter durablement la réponse des LT. Enfin, il a été démontré que c’est la voie canonique (dont les effets sont la conséquence de l’induction de la transcription de
gènes cibles par l’association du NICD avec RBPJk aux promoteurs de ces dernières suites à l’activation de la voie par les ligands) qui est responsable des effets induits par la voie Notch dans les LT CD8 dans le cadre d’une réaction du greffon contre l’hôte ou d’une infection virale par le virus de la grippe473,536. Cependant, il serait intéressant de comprendre les modalités de l’activation de la voie de signalisation Notch dans les LT CD8, suite à une infection bactérienne aiguë. Nous souhaiterions évaluer lequel des deux récepteurs Notch1 ou Notch2 est important dans la réponse lymphocytaire ou si ces deux récepteurs ont des rôles redondants ou distincts. L’étude du Dr Amsen démontre que ces deux récepteurs, Notch1 et Notch2, ont des rôles redondants dans la génération de SLEC, Notch1 ayant un rôle prédominant. L’infection de souris dont les LT CD8 seraient déficientes pour Notch1 uniquement ou pour Notch2 uniquement permettra de répondre à cette question. L’utilisation d’anticorps bloquants dirigés contre chacun des ligands, seuls ou en combinaisons, et à différents moments de la réponse lymphocytaire nous permettra de déterminer quels sont les ligands responsables de l’activation de la voie et le moment où cette dernière doit être activée pour induire ses effets au sein des LTe. Enfin, l’infection de souris exprimant une forme tronquée de la protéine MAML, empêchant ainsi son interaction avec le NICD et donc d’induire la transcription de gènes cibles, permettra de comprendre si les effets induits par la voie Notch dans les LT CD8 est la conséquence de l’activation de la voie canonique ou non de Notch.
Mieux connaître les modalités de l’activation de la voie de signalisation Notch est important pour permettre l’établissement de stratégie thérapeutique visant à activer ou supprimer son activation.