Perspectives

1. Mécanismes d’action de Polθ dans sa fonction régulatrice du timing de réplication. Dans la continuité de ces travaux, il sera intéressant de comprendre comment Polθ exerce son rôle dans la régulation du timing de réplication et de préciser son mécanisme d’action. Les résultats obtenus montrent une modulation du timing de réplication sur 5 à 20% du génome, après extinction ou surexpression respectivement de l’ADN polymérase Thêta. Parallèlement, les expériences de co-immunoprécipitation suggèrent que Polθ est localisée au niveau d’origines de réplication. Il sera donc intéressant de déterminer quelles sont les cibles de Polθ, c’est-à-dire sur quelles séquences elle vient se fixer en phase G1. En particulier, Polθ comportant un domaine hélicase, et les origines de réplication ayant été associées à la présence des structures secondaires d’ADN, les G-quadruplex, on peut spéculer sur un type de régulation via la déstructuration de ces G4. Pour répondre à cette question des séquences de recrutement de Polθ à la chromatine, nous avons envisagé une approche par immunoprécipitation de la chromatine suivie d’un séquençage des fragments d’ADN immunoprécipités (ChIP-seq). Au cours de ma quatrième année de thèse, j’ai mis au point les conditions de fragmentation de l’ADN par digestion enzymatique et d’immunoprécipitation de Polθ. J’ai réalisé les ChIP sur deux lignées cellulaires : les cellules RKO synchronisées en G1, dans lesquelles les précédentes études ont été faites, et les K562, cellules pour lesquelles nous disposons de nombreuses données génétiques et épigénétiques accessibles. Les expériences sont en cours de finalisation et les échantillons devraient être envoyés pour séquençage dans les semaines à venir.

Le recrutement d’une ADN polymérase en phase G1 du cycle cellulaire paraît contre- intuitive étant donné qu’il n’y a priori pas de synthèse d’ADN au cours de cette phase du cycle cellulaire. Cependant, il est possible que le recrutement ait lieu en G1 mais son activation au cours de la phase S suivante. De plus, comme évoqué précédemment, Polθ

possède aussi un domaine hélicase qui peut être impliqué dans cette fonction. Pour déterminer si un des domaines en particulier est important pour son recrutement en G1 et son rôle dans le

timing de réplication, il sera intéressant de travailler avec des mutants de la protéine pour

évaluer leur impact sur le recrutement de Polθ et des Mcm à la chromatine en G1, ainsi que sur le timing de réplication. Comme décrit précédemment (Yousefzadeh et al., 2014), l’inactivation du domaine polymérase provient de mutations de 2 acides aminés D2330A et Y2331A. L’inactivation du domaine hélicase est issue de la substitution dans le motif hélicase I, de la lysine K120 par une alanine (K121A). En effet, la mutation de ce résidu dans HEL308, homologue du domaine hélicase de Polθ abolit son activité hélicase. Deux stratégies peuvent être envisagées ensuite : l’expression transitoire des mutants après extinction de la protéine endogène par un siRNA ciblant la région non codante 3’UTR de l’ARNm de POLQ, ou l’utilisation du système CRISPR/Cas9 qui permet de muter directement la protéine endogène in situ. Ce système a le double avantage de s’affranchir totalement de la forme sauvage de la protéine, et de conserver une régulation physiologique de l’expression des mutants de Polθ. En revanche, il implique de travailler avec des mutants stables qui peuvent mettre en place des voies de compensation et d’adaptation à la mutation.

Enfin, une dernière approche pour comprendre les mécanismes de régulation de Polθ sur le timing de réplication sera d’en identifier les partenaires en couplant les IP à des analyses en spectrométrie de masse. De façon à concentrer nos recherches sur son rôle dans le

timing de réplication, et non dans la réparation ou l’élongation en cours de phase S, ces IP

seront réalisées en phase G1, qui est je le rappelle la phase où se décide le timing de réplication.

2. L’impact de la modification du timing de réplication suite à la dérégulation de Polθ Si nous avons observé une modification du timing de réplication en fonction du statut de Polθ, les conséquences cellulaires de ces modifications sont totalement inconnues. En particulier, il serait intéressant d’évaluer si des modifications transcriptionnelles, ou en terme d’instabilité génétique ont lieu suite à cette dérégulation temporelle de l’activité des origines.

Tout d’abord, comme nous l’avons vu en introduction, il existe un lien entre transcription et timing de réplication, les régions précoces étant majoritairement transcriptionnellement actives, et les régions tardives réprimées. Il sera donc intéressant de voir si ces modifications du timing de réplication s’accompagnent d’une modification de l’expression génique en fonction du statut de Polθ, et si tel est le cas, si un processus

domaines dont le timing est modifié sont impliqués dans une multitude de voies de signalisation (Annexe1). Seule l’analyse transcriptionnelle pourra donc dire si l’expression des gènes est modifiée pour une ou plusieurs voies en particulier. Dans le cas où Polθ est surexprimée, le retard de réplication observé suggère qu’un certain nombre de gènes, contenus dans les régions affectées, pourrait être réprimés. Or, compte tenu de la signature de cette ADN polymérase dans les cancers, il serait intéressant de voir si des gènes suppresseurs de tumeurs peuvent être par exemple réprimés, comme cela a été décrit dans le cas du cancer du sein (Fritz et al., 2013).

Ensuite, les régions répliquées en fin de phase S sont soumises à une instabilité génétique plus forte que les régions précoces (mutations ponctuelles, amplifications, translocations). Et les travaux de Lemée et al. ont montré que la surexpression de Polθ induit une forte instabilité chromosomique (Lemée et al., 2010). Des analyses cytogénétiques ciblant les régions dont le timing est modifié pourraient permettre de voir si de telles modifications génétiques sont particulièrement enrichies dans ces régions retardées.

CHAPITRE II : MODIFICATION DU TIMING DE RÉPLICATION