Perspectives

Le travail effectué au sein du Laboratoire d’Ingénierie des Protéines Membranaires durant ces années de thèse, ainsi que les recherches réalisées dans d’autres groupes, ont confirmé le caractère dynamique de la CPR et des protéines de la famille des diflavines réductases en général. Il ne s’agit ici pas seulement de mouvements ponctuels, à l’échelle d’un résidu ou d’un site de fixation, mais de larges déplacements de domaines entiers, la structure même de ces domaines est par ailleurs a priori parfaitement conservée au cours de ces mouvements, ou du moins dans les deux conformations extrêmes. Ces résultats permettent également de mieux cerner les facteurs ou paramètres pouvant influencer, voir même dicter cette dynamique. Il existe chez d’autres diflavines réductases telles que les NOS des motifs structuraux (queue C-terminale, site de fixation de la CaM, boucle d’auto-inhibition, et β-fingers), absents de la CPR, et jouant explicitement des rôles de régulateurs d’activité en contrôlant notamment le positionnement du domaine FMN vis-à-vis de ses partenaires. On peut alors se demander si, en l’absence de motifs régulateurs visibles, la CPR ne subit pas des mouvements aléatoires entre les formes ouverte et fermée, prenant des électrons lorsque la source électronique se fixe, et les transférant au premier accepteur externe venu. Or non seulement un tel fonctionnement serait extrêmement peu efficace (fuites d’électrons), mais par ailleurs la fixation du ligand NAD(P)H et/ou la réduction du cofacteur FAD stabilisent la forme fermée de la CPR. Les mouvements de domaine de cette réductase, bien que moins contrôlés que ceux de la NOS, ne semblent donc pas non plus totalement aléatoires. Finalement, il se peut que des éléments protéiques ou des facteurs externes de régulation n’aient pas encore été identifiés. Ceux-ci pourraient peut-être expliquer le rôle du domaine de connexion qui reste encore incompris.

Les développements futurs de ce travail viseront probablement l’étude directe de la dynamique de la CPR en utilisant des méthodes d’analyses spécifiques telles que le FRET, la RMN hétéronucléaire ou encore le SAXS. Nous avons tenté au cours de ce travail de développer une stratégie de marquage des différents domaines de la CPR par des fluorophores distincts, afin de suivre la distance moyenne entre les domaines catalytiques en fonction du potentiel d’oxydoréduction ou de la présence de tel ou tel facteur (NAD(P)H, accepteurs…). La technique d’expression et de purification séparées des domaines via une fusion avec des intéines n’a malheureusement pas abouti. Quoiqu’il en soit, d’autres stratégies alternatives sont actuellement développées au laboratoire, telles que l’introduction d’acides aminés non naturels autorisant le marquage sélectif des domaines pour des mesures de FRET. Par ailleurs, des expériences de SAXS dans des conditions d’anaérobie autorisant l’imposition d’un potentiel d’oxydoréduction spécifique à la solution protéique analysée, devraient permettre de suivre l’évolution de l’enveloppe globale de la CPR en fonction de son état rédox et de la présence d’autres cofacteurs. Finalement, des études de RMN hétéronucléaire seraient applicables à la CPR malgré sa taille, si elles se focalisent sur les modifications structurales au niveau des interfaces entre les domaines qui sont justement représentatives de l’état conformationnel général de l’enzyme.

La collaboration fructueuse avec le Laboratoire d’Enzymologie et de Biologie Structurale (CNRS – Gif-sur-Yvette), qui nous a permis de résoudre la structure de la CPR chimère YHs dans une conformation jusqu’alors inconnue, continue également. Le projet principal vise à co-cristalliser cette

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CPR avec un cytochrome P450 afin de valider l’hypothèse selon laquelle une forme ouverte de la CPR correspond bien la conformation de la protéine dans le complexe bimoléculaire de transfert d’électrons. En effet, la structure du domaine FMN isolée du P450-BM3 co-cristallisée avec le cytochrome P450 lui-même (Sevrioukova et al., 1999b) n’est pas compatible avec les formes fermées de la CPR ; l’alignement des domaines FMN dans les deux structures conduisant à un recouvrement (clash) entre le domaine FAD de la CPR fermée et le cytochrome P450. Par contre, l’alignement de notre forme ouverte de YHs avec le domaine FMN du complexe P450-BM3 est tout à fait compatible (Figure 91). Mais si cet alignement n’est pas une preuve en soi de la structure du complexe cytochrome P450/CPR, leur co-cristallisation dans une conformation analogue serait bien plus probante.

Figure 91 : Alignement des structures du complexe cytochrome P450-BM3/domaine FMN (Sevrioukova et al., 1999b) (1BVY) et de YHs (3FJO). Le cytochrome P450 est en rouge et son cofacteur hémique en vert. YHs et en orange avec les cofacteurs flaviniques en bleu, et le domaine FMN co-cristallisé avec le cytochrome P450 est en beige avec la molécule de FMN en bleu clair.

Par ailleurs, il serait très intéressant d’utiliser notre analyse des zones d’interactions entre les domaines chez les CPR parentales et YHs pour tenter de construire des révertants chimériques adoptant préférentiellement une conformation fermée. Il s’agirait plus précisément de réintroduire par mutagénèse dirigée les acides aminés impliqués dans des interactions spécifiques à l’une ou l’autre des CPR parentales, ces interactions ayant été perdues lors de la construction des chimères. Une étude structurale et/ou dynamique de tels révertants confirmerait ou infirmerait le rôle des interactions identifiées dans la stabilisation de la forme fermée adoptée par les CPR natives.

A plus long terme, il serait intéressant de suivre les mouvements des domaines de la CPR en temps réel au cours de son cycle catalytique. Les méthodes d’analyses sur molécule unique sont particulièrement appropriées à ce type de recherche car elles permettent de s’affranchir des problèmes de moyennage dus à l’absence de synchronisation entre les molécules d’une solution qui diminuent le caractère informatif des mesures effectuées. En appliquant ces techniques à l’étude de protéines multidomaines ou de complexes multiprotéines, il devient alors possible d’analyser le positionnement de différentes entités structurelles les unes par rapport aux autres, et d’en suivre l’évolution. Mais de telles expériences nécessitent non seulement des outils de mesure et d’analyse spécifiques, mais aussi une préparation des échantillons complexe et délicate. Quoi qu’il en soit, ces méthodes permettant de suivre le comportement d’une molécule au cours du temps font

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certainement partie des outils les plus appropriés pour l’analyse dynamique de protéines. Le développement des méthodes d’analyse citées plus haut approfondira notre compréhension des mécanismes dynamiques au cours des cycles catalytiques des CPR mais également des diflavines réductases en général. La description des évènements moléculaires à l’origine des mouvements de domaines dans ces protéines redox et leurs conséquences en termes de géométrie globable devrait également s’appliquer à d’autres protéines multidomaines.

Depuis quelques années, les protéines multidomaines ne sont plus perçues comme des blocs figés mais plutôt comme des assemblages dynamiques d’éléments, de motifs ou de domaines. Comprendre les interconnexions et les réseaux de communications entre ces entités protéiques, c’est avancer d’un pas dans la résolution des phénomènes régissant le fonctionnement de ces protéines. Ce travail a approfondi notre compréhension du mode d’action des systèmes de transport d’électrons au P450. Nos résultats valident l’hypothèse selon laquelle la CPR est une protéine dynamique dont la réorganisation conformationnelle, à l’échelle des domaines, contrôle son cycle catalytique et son interaction avec ses partenaires redox. La construction et l’analyse de protéines multidomaines chimériques a confirmé le rôle important des interfaces qui, à mon sens, constituent un élément descripteur des protéines au même titre que les domaines. Notre étude n’a pas encore répondu aux nombreuses interrogations concernant le rôle exact du domaine de connexion dans le contrôle de la géométrie de la CPR et, comme c’est souvent le cas dans la recherche, ont suscité de nouvelles questions.

Oh teachers are my lessons done?

I cannot do another one.

They laughed and laughed and said « Well child,

Are your lessons done? »

« Teachers »

Leonard Cohen

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Membrane du réticulum endoplasmique

CPR

C