2 PCR spécifique d’un genre, d’une espèce ou d’une sous-espèce

La PCR spécifique a été appliquée à des isolats représentatifs de chaque groupe Rep-PCR. La PCR spécifique à appliquer a été choisie en fonction de l’affiliation présomptive des isolats à l’issue de la Rep-PCR.

Ainsi, ont été réalisées des PCR spécifiques du genre Enterococcus, des espèces du groupe Lactobacillus plantarum, et des sous espèces lactis et cremoris de Lc. lactis.

Principe

La PCR spécifique cible un fragment d’ADN de séquence connue, qui varie en fonction du genre, de l’espèce, ou de la sous-espèce selon la spécificité recherchée. Un seul fragment PCR de taille connue est alors obtenu après amplification avec des amorces bornant le fragment à amplifier. On vérifie la présence et la taille du fragment amplifié par une électrophorèse sur gel d’agarose.

Mode opératoire commun

Le mélange réactionnel était le même pour chaque PCR spécifique et chaque PCR universelle, à l’exception de l’ADN cible et de la paire d’amorces. Ce mélange était le suivant : 1ng/µl d’ADN, 200 µM de chaque nucléotide)( ATP, CTP, GTP et TTP), 2,5 mM de MgCl2, du tampon 1x + MgCl2(Q-Biogen EPQBT025), et 0,25 µM de chaque amorce.

A partir du même mélange réactionnel contenant tous les éléments, sauf les amorces, plusieurs réactions PCR ont été réalisées :

- Une PCR visant à s’assurer de la présence d’ADN cible avec la paire d’amorce universelle 16/23, qui cible chez tous les ADN bactériens respectivement l’extrémité 3’ du gène codant l’ARN ribosomique 16S dans le sens 5’vers 3’, et l’extrémité 5’ du gène codant l’ARN ribosomique 23S dans le sens 3’vers 5’.

 amorce 16 : GCTGGATCACCTCCTTTC  amorce 23 : AGTGCCAAGGCATCCACC

- Une PCR visant à détecter la présence de séquence(s) spécifique(s) sur l’ADN cible avec la(les) paire(s) d’amorce(s) spécifique(s) indiquée(s) pour chaque PCR spécifique. Une réaction PCR était mise en œuvre pour chaque paire d’amorces spécifiques.

Ces deux types de réactions PCR doivent être mises en œuvre pour chaque série d’amplification à partir des ADN de référence qui servent de témoins positif ou négatif, et des ADN des isolats qui sont à identifier. L’utilisation des ADN témoin est indispensable. Les profils électrophorétiques obtenus à partir de ces ADN permettent de contrôler que la PCR spécifique s’est déroulée dans de bonnes conditions et servent de référentiel (nombre et taille des fragments PCR qui doivent être obtenus) pour lire les profils électrophorétiques à partir de l’ADN de chaque isolat. Une réponse sans l’ADN témoin n’est pas valide.

Les fragments PCR étaient soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose standard à 1,5 % pendant environ 3 h sous une tension de 90 V; en plus des réactions PCR, un marqueur de taille était déposé; les fragments PCR étaient ensuite révélés par une coloration identique à celle décrite pour la Rep-PCR.

PCR spécifique du genre Enterococcus

Le mode opératoire a été décrit par Bendimerad et al. (2012). Il utilise une amorce spécifique, Enc38, dessinée par Frahm et al. (1998), et une amorce universelle, conrev23 (Berthier and Ehrlich,1998).

La paire d’amorce Enc38/conrev23 permet d’amplifier un fragment à partir des ADN

d’E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. gallinarum, E. mundtii, et E. casseliflavus, c’est-à-dire

L’amorce spécifique Enc38, qui cible le gène codant l’ARN ribosomique 23S, a pour séquence :

CTCTACCTCCATCATTCT.

L’amorce conrev23 a la séquence complémentaire de la séquence 23.

Les ADN des souches de référence CIP53.48T (E. hirae), ATCC19432T (E. durans) et ATCC19433T(E. faecalis) ont servi de témoins positifs; l’ADN de la souche CNRZ 142T (L.

lactis subsp. lactis) a été utilisé comme témoin négatif.

Le programme d’amplification était identique à celui décrit plus loin pour la PCR spécifique de l’espèce L. plantarum.

Le programme utilisé (durée 2 h) pour l’amplification était un programme de 30 cycles comportant les trois étapes suivantes par cycle : 94 °C pendant 1 min, 53 °C pendant 0 min et 72 °C pendant 1 min.

PCR spécifique de l’espèce Lactobacillus plantarum

Le mode opératoire et l’interprétation ont été ceux décrits par Berthier et Ehrlich (1998). La paire d’amorce plant/16 n’amplifie que l’ADN de L. plantarum, alors que la paire d’amorce papl/16 amplifie les ADN de L. plantarum et de L. paraplantarum. L. paraplantarum est l’espèce la plus proche phylogéniquement de l’espèce L. plantarum. En cas d’amplification, un seul fragment d’environ 220 bp est obtenu (figure 36).

Figure 36 : Amplification des ADN de L. plantarum et L. paraplantarum avec les paires d’aporces 16/Lpapl(=papl) et 16/Lpl(=plant) (Berthier et Ehrlich, 1998).

Les ADN de référence étaient : CNRZ 211T (L. plantarum), témoin positif, et CNRZ 1885T(L. paraplantarum), témoin négatif.

Les séquences des amorces spécifiques, qui ciblent la grande séquence intergénique 16S-23S, étaient :

- amorce plant : ATGAGGTATTCAACTTATG pour L. plantarum - amorce papl : ATGAGGTATTCAACTTATT pour L. paraplantarum. Ces amorces ont été associées à l’amorce universelle 16.

La séquence de l’amorce universelle, qui cible la séquence du gène codant l’ARN ribosomique 16S, était :

amorce 16 : GCTGGATCACCTCCTTTC

Le programme utilisé (durée 2 h) pour l’amplification était un programme de 30 cycles comportant les étapes suivantes/cycle : 94 °C pendant 1min, 53 °C pendant 0 min et 72 °C pendant 1min. Il était identique à celui utilisé pour la PCR spécifique du genre Enterococcus.

PCR spécifique des sous espèces lactis et cremoris de L. lactis

Le couple d’amorces spécifiques LHis 5F et LHis 6F, le mode opératoire et l’interprétation décrits par Beimfohr et al. (1997) ont été utilisés.

Ces amorces sont issues de la séquence de l’opéron histidine décarboxylase : - amorce Lhis 5F : CTTCGTTATGATTTTACA

- amorce Lhis 6F : AATATCAACAATTCCATG

Le couple d’amorces Lhis6F et Lhis5F permet de distinguer Lc.lactis subsp.

lactis/hordniae de Lc lactis subsp.cremoris. L’amplification de l’ADN de Lc.lactis subsp. lactis/hordniae donne un fragment de 934 pb, alors que l’amplification de l’ADN de Lc lactis

subsp.cremoris donne un fragment de 1149 pb.

A côté de l’ADN des isolats, trois ADN témoins ont été amplifiés: ceux des souches CNRZ 142T (Lc.lactis subsp. lactis), CNRZ 105T (Lc lactis subsp.cremoris) et CNRZ 125 (Lc.lactis subsp lactis biovar diacetylactis).

Les ADN ont été amplifiés selon un programme de 30 cycles comprenant les trois étapes suivantes par cycle : 94 °C pendant 10 s, 46 °C pendant 1 min 30 s et 72 °C pendant 2 min.

V- CARACTERISATION PHENOTYPIQUE DES ISOLATS