CARACTERISATION PHENOTYPIQUE DES ISOLATS

Réalisé au laboratoire de microbiologie (actuellement LAMAABE), Université Tlemcen, Algérie.

Le type de morphologie des isolats a été déterminé après avoir fixé les cellules, les avoir colorées avec les colorants de Gram, puis les avoir observées au microscope optique

V.2 Caractères physiologiques

Croissance à différentes températures

Réalisée à l’URTAL, INRA Poligny, France.

La capacité des isolats lactiques à croître entre 10 °C et 40 °C a été testée après les avoir ensemencés en strie sur les milieux de cultures gélosés M17 ou MRS, puis les avoir incubés en aérobiose pendant 24h à soit 10 °C, soit 25 °C, soit 30 °C, soit 37 °C et soit 40 °C. La lecture des résultats a consisté à observer à l’œil nu la présence (résultat positif) ou l’absence (résultat négatif) de colonies à la surface des géloses.

Croissance sur milieu salé

Réalisé au laboratoire de microbiologie (actuellement LAMAABE), Université Tlemcen, Algérie.

La capacité des isolats lactiques à croître sur des milieux salés a été testée en MRS ou M17 gélosés supplémentés par soit 2,5 %, soit 3,0 %, soit 4 % et soit 6,5 % (p / v) de NaCl. Les milieux ont été ensemencés en stries puis incubés en aérobiose à 30 °C pendant 48 h avec une lecture à 24 h. La lecture des résultats a consisté à détecter la présence (résultat +) ou l’absence (résultat -) de colonies à la surface des géloses.

V.3 Caractères biochimiques

Réalisé au laboratoire de microbiologie (actuellement LAMAABE), Université Tlemcen, Algérie.

Test de la catalase

La dégradation du peroxyde d’hydrogène en eau et oxygène par la catalase a été testée en mettant en contact une colonie bactérienne ayant poussé sur MRS ou M17 gélosé avec une goutte d’eau oxygénée (0,02 ml). L’absence de bulles de gaz a traduit l’absence d’activité catalase.

Type fermentaire

Ce test permet de discriminer les isolats lactiques qui sont homofermentaires, stricts ou facultatifs, de ceux qui sont hétérofermentaires stricts. Il a été réalisé en cultivant les isolats sur milieu MRS ou M17 (selon le milieu sur lequel il avait été isolé) en aérobiose à 30 °C pendant 48 h et en plaçant une cloche de Durham. Une lecture a été faite à 24h. En cas d’absence de gaz dans la cloche, l’incubation a été poursuivie 24 h supplémentaires. Les isolats qui ont produit du gaz dans les cloches ont été notés héterofermentaires stricts; les isolats qui n’ont pas produit de gaz dans les cloches ont été notés homofermentaires.

Voie des acides mixtes

Ce test a été utilisé pour mettre en évidence la voie des acides mixtes pour les coliformes présomptifs. Un bouillon Clark et Lubs a été ensemencé à partir d’un bouillon

ont été alors rajoutées. Les cultures pour lesquels le milieu a viré du jaune au rouge, témoignant de la production des acides mixtes, ont été notés voie des acides mixtes « + ».

Utilisation du citrate

La capacité des isolats lactiques à utiliser le citrate a été testé après ensemencement du milieu liquide KMK. Les isolats dont les colonies apparaissaient de couleur bleue après 48 h d’incubation en aérobiose à 30 °C ont été notés « + » pour l’utilisation du citrate (Kempler et McKay 1980).

La capacité des coliformes présomptifs à utiliser le citrate a été testé sur le milieu en tube incliné « citrate de Simmons », ensemencé en stries en surface à partir d’un bouillon BLBVB positif (cf. § VII-1), puis incubé une nuit à 37 °C. Les cultures pour lesquelles le milieu est passé du vert au bleu, témoignant de la dégradation du citrate, ont été notées citrate « + ».

Hydrolyse de l’arginine

Ce test a été réalisé par ensemencement en stries d’une colonie sur le milieu solide M16BCP et incubation en aérobiose à 30 °C pendant 24 h. Les isolats lactiques dont les colonies se distinguaient par leur couleur blanche ont été notés « + » pour l’utilisation de l’arginine (Thomas, 1973).

Recherche de protéase

L’isolat lactique a été ensemencé sous forme de spot sur une gélose YMA (Yeast milk agar) riche en lait (voir composition en annexe) incubée en aérobiose pendant 24 h à 30 °C; les isolats dont les colonies étaient entourées d’une zone transparente (correspondant à une hydrolyse des caséines) ont été notés (+) pour la présence de protéase.

Production de dextrane

Ce test a été réalisé pour les isolats appartenant au genre Leuconostoc. Ces derniers ont été ensemencé en strie sur du milieu MRS saccharosé (50g l-1de saccharose). Après 24 h d’incubation en aérobiose à 30 °C les isolats dont les colonies avaient un aspect muqueux ont été notés « + » pour la production de dextrane (Dellaglio et al., 1994), (Bauer et al, 2009)

Production d’acétoine

La capacité des isolats lactiques à produire de l’acétoine a été recherchée après croissance des isolats dans du lait écrémé stérilisé incubé en aérobiose à 30 °C pendant 24 h; deux gouttes de VPI et deux gouttes de VPII (alpha-naphthol and potassium hydroxide, réactifs I et II de Voges Proskauer) ont été rajoutés dans le lait. Les isolats qui ont produit un anneau rose à la surface du lait ont été notés « + » pour la production d’acétoine.

gouttes du réactif VPI et deux gouttes du réactif VPII (réactifs de Voges Proskauer) ont été rajoutées au bouillon. Les cultures qui ont produit un anneau rose à la surface du lait ont été notés « + » pour la production d’acétoine.

Production d’indole

La capacité des coliformes présomptifs à produire de l’indole a été recherchée après culture des coliformes présomptifs dans une eau peptonée exempt d’indole, ensemencée par un aliquot de milieu BLBVB positif (cf. § VII-1). Après 24 h d’incubation à 37 °C, quelques gouttes du réactif de Kovacs ont été rajoutées. Les cultures qui ont produit un anneau violet, témoin de la production d’’indole à partir du tryptophane, ont été notés indole « + ».

Utilisation des sucres

La production d’acide à partir d’un sucre par les isolats lactiques a été attestée de l’utilisation de ce sucre. Après revivification des isolats en milieux MRS ou M17 liquides pendant 24 h à 30 °C, les cellules ont été récupérées sous forme de culot par centrifugation à 400 tours/minute pendant 10 min. Deux lavages successifs du culot avec 5 ml d’eau physiologique stérile ont été réalisés. 10 ml du milieu liquide MRS ou M17 sans sucre ont été ensemencés par 100 µl de la suspension bactérienne précédemment obtenue, puis complémentés par quelques gouttes d’une solution aqueuse du sucre à tester (à 10 g l-1) et quelques gouttes d’une solution aqueuse de pourpre de bromocresol (à 0.04 l g-1). Une atmosphère anaérobique a été créée par l’addition d’une couche de paraffine à la surface, puis les tubes ont été incubés à 30 °C pendant 24 h. L’utilisation du sucre a été notée « + » lorsque le milieu avait viré au jaune.

L’utilisation du glucose, lactose et saccharose par les coliformes présomptifs a été testée sur le milieu solide TSI, en gélose inclinée dans un tube à essai. La partie inférieure, non inclinée, contient du glucose ; la partie inclinée contenant le lactose et le saccharose. Une piqûre centrale, puis un ensemencement en surface, permettent de voir les résultats après 24 h à 37 °C. L’utilisation du sucre a été notée « + » lorsque le milieu avait viré au jaune.