Dans certaines conditions d´ependantes de l’´etat de surface du guide utilis´e (i.e. sa propret´e ou sa fonctionnalisation chimique), les objets ont tendance `a se coller au guide. Ceci se traduit par une suppression du mouvement brownien des particules qui nous sera utile par la suite pour d´eterminer si les particules sont libres ou sont adh´erentes `a la surface du substrat et donc dans l’impossibilit´e d’ˆetre d´eplac´ees par l’onde ´evanescente.
Afin d’´eviter l’adh´esion des particules sur la surface de la plaquette de guide d’onde, nous avons entrepris la recherche d’un compos´e susceptible de passiver efficacement la surface de nos guides et empˆecher les interactions des particules avec la surface. Ces interactions peuvent
engendrer un frottement plus important de la particule avec le substrat voire mˆeme bloquer cette derni`ere sur la surface, rendant impossible tout d´eplacement ult´erieur.
Plusieurs travaux se sont int´eress´es au probl`eme de l’adsorption des mol´ecules biologiques sur diff´erents types de substrat [149] [150] [151] [152] [153].
D’une mani`ere g´en´erale, lors d’une exp´erience de d´epˆot de cellules sur une surface synth´etique, on doit tenir compte non seulement de l’adsorption des prot´eines s´ecr´et´ees par les cellules, en particulier la matrice extra cellulaire (MEC), mais ´egalement des prot´eines qui peuvent ˆetre contenues dans le milieu baignant les cellules, et en particulier la BSA (s´erum albumine bo- vine) et le SVF (s´erum de veau foetal). De plus, dans certaines exp´eriences, on peut vouloir pr´econditionner un support avec une ou plusieurs prot´eines en les laissant s’adsorber `a la sur- face ; ces prot´eines peuvent favoriser l’adh´esion des cellules (ligands sp´ecifiques) ou inversement la d´efavoriser (BSA, SVF) en entrant en comp´etition d’adsorption avec les prot´eines favorisant l’adh´erence (MEC s´ecr´et´ee).
Bri`evement, la matrice extra cellulaire est compos´ee de glycoprot´eines, en particulier le col- lag`ene, l’´elastine, les prot´eoglycanes, les prot´eines d’adh´esion comme la fibronectine, la laminine, la vitronectine, et de sucres comme l’acide hyaluronique par exemple.
Les macromol´ecules pr´esentes dans la matrice extracellulaire sont synth´etis´ees et s´ecr´e–t´ees par les cellules adh´erentes (chondrocytes, ost´eocytes, etc.) lors de leur contact avec la matrice extracellulaire. Cette matrice est reconnue de fa¸con sp´ecifique par des r´ecepteurs dispos´es sur la membrane cellulaire, en particulier les int´egrines ou le r´ecepteur `a la laminine, qui reconnaissent respectivement la fibronectine et la laminine, mais aussi d’autres glycoprot´eines [154]. Cette matrice sert de base indispensable `a la croissance et au d´eveloppement des cellules adh´erentes sur un substrat.
Dans le cas particulier de la silice et du verre - les mat´eriaux utilis´es pour la fabrication de nos guides -, Zhang et al. montrent qu’un compos´e hydrophile, le poly´ethyl`ene glycol (PEG), r´eduit consid´erablement l’adsorption des prot´eines et l’adh´erence cellulaire [152]. Un film de PEG couvrant du SiO2 tend `a ´ecranter les charges n´egatives du SiO2 et ainsi `a r´eduire l’adsorption
des prot´eines. Les auteurs pensent qu’en plus de la diminution des interactions ioniques, on doit tenir compte de la force st´erique du PEG dans la r´eduction de l’adsorption prot´eique et/ou de l’adh´esion des cellules.
Dans ces travaux, ce n’est pas le crit`ere d’hydrophilicit´e qui peut ˆetre retenu. En effet, les travaux de Dewez et al en particulier [150] [151] [153] qui ont vis´e `a ´etudier l’influence des
propri´et´es physico-chimiques des substrats, `a savoir l’hydrophobicit´e et la charge ´electrostatique de surface du substrat sur l’adsorption des prot´eines, ont montr´e que quand le mat´eriau est extrˆemement hydrophobe (angles de contact des gouttes d’eau compris entre 85 et 100˚, par exemple sur le polystyr`ene brut), les prot´eines sont tr`es mal adsorb´ees. Les auteurs notent ´
egalement que lorsque le mat´eriau perd de son hydrophobicit´e (traitement plasma O2 ou N H3
provoquant une modification de la chimie de surface), le mat´eriau devient beaucoup plus r´eceptif aux prot´eines qui adsorbent mieux : les prot´eines sont adsorb´ees lorsque l’angle de mouillage devient inf´erieur `a 50˚.
Dans le cas du PEG qui est tr`es hydrophile, il semblerait donc que ce soit plutˆot l’´ecrantage des charges du substrat (perte de l’interaction ionique) et surtout son caract`ere st´erique r´epulsif qui soit en cause, d’apr`es Zhang et al.
Depuis ces travaux, les mat´eriaux sur lesquels sont greff´ees des chaˆınes de poly´ethyl`ene glycol sont souvent consid´er´es comme particuli`erement bien adapt´es pour r´eduire l’adh´esion cellulaire et l’adsorption non sp´ecifique de prot´eines. Toutefois, il est important de noter que si notre objectif est d’´eviter l’adh´esion des cellules et particules sur nos guides, on peut ´egalement ´
emettre l’hypoth`ese que l’adsorption de prot´eines `a la surface de ces mˆemes guides pourrait perturber le m´ecanisme de pi´egeage et de d´eplacement par ondes ´evanescentes guid´ees.
Nous nous sommes donc logiquement orient´es vers le greffage de PEG en surface de notre substrat de silice pour atteindre cet objectif. Plus pr´ecis´ement, nous avons effectu´e une r´eaction de silanisation utilisant du silane-PEG. En effet, la m´ethode de greffage la plus utilis´ee consiste `a faire r´eagir un silane sur le groupement silanol SiOH pr´esent `a la surface de la silice. La r´eaction de silanisation consiste donc en une substitution des atomes d’hydrog`ene des groupements silanol par un groupement organosilyl.
Cette r´eaction de silanisation a ´et´e largement employ´ee, notamment pour des techniques analytiques, en chromatographie en phase liquide [155] ou en chromatographie en phase gazeuse [156] pour le greffage de divers groupements sur des surfaces de silice. Le compos´e de silane-PEG nous a ´et´e fourni par l’´equipe de chimistes de notre laboratoire. Le PEG utilis´e est le PEG 400. En effet, les poly´ethyl`ene glycols sont une famille de polym`eres dont le poids mol´eculaire varie en fonction du nombre de groupements d’oxyde d’´ethyl`ene n dans la mol´ecule. Leur formule chimique s’´ecrit : H(OCH2CH2)nOH. Dans notre cas du PEG 400, le monom`ere de base est
r´ep´et´e neuf fois (n = 9).
La m´ethode de greffage du PEG sur nos surfaces est la suivante :
pr´esentes. Id´ealement, ce nettoyage s’effectue au m´elange piranha (30% H2O2, 70% H2SO4).
Cependant, ce m´elange ´etant extrˆemement agressif, nous n’avons pas pris le risque d’en- dommager nos guides nitrure dont la taille est tr`es faible (200 nm de hauteur). Nous avons donc simplement nettoy´e les ´echantillons `a l’ac´etone, `a l’eau d´esionis´ee, et `a l’´ethanol, tel que le recommandent les technologues pour le nettoyage des plaquettes de silicium. 2. Les surfaces sont ensuite plong´ees dans une solution de silanisation, de fa¸con `a recouvrir
la lame de silicium. Cette solution est compos´ee de silane-PEG `a 1% dans le tolu`ene. 3. Le d´epˆot en phase liquide de silane-PEG dure deux heures. La lame est ensuite rinc´ee au
tolu`ene, puis `a l’ac´etone, puis le d´epˆot est recuit au four `a 115˚C pendant deux heures. 4. La lame est ensuite prˆete pour ˆetre test´ee.
Puisque nous avons vu pr´ecedemment que les travaux de Dewez et al ont montr´e l’efficacit´e des surfaces hydrophobes contre l’adsorption de prot´eines - adsorption de prot´eines qui peut potentiellement interagir par la suite avec les cellules et donc contrarier nos exp´eriences de d´eplacement cellulaire - nous avons ´egalement d´epos´e un compos´e tr`es hydrophobe sur nos lames, le perfluorosilane (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-tri´ethoxysilane), par une m´ethode de silanisation semblable `a la pr´ec´edente. Le protocole est le suivant :
1. Les surfaces sont d’abord nettoy´ees `a l’ac´etone, `a l’eau d´esionis´ee, et `a l’´ethanol.
2. La lame est immerg´ee dans une atmosph`ere satur´ee par une solution de pentane conte- nant 1% de perfluorosilane (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-tri´ethoxysilane) vers´ee dans un dessicateur.
3. Le d´epˆot en phase vapeur de perfluorosilane dure deux heures. La lame est ensuite rinc´ee `
a l’ac´etone, puis le d´epˆot est recuit au four `a 115˚C pendant deux heures. 4. La lame est ensuite prˆete pour ˆetre test´ee.