Origine embryonnaire des cellules ESCs

Les lignées de mESCs sont fabriquées à partir de l’ICM du blastocyste, mais ceci ne veut pas dire qu’elles en sont la copie conforme. Les mESCs ont dû s’adapter pour se maintenir en autorenouvellement en culture in vitro. Nous avions fait un lien entre mESCs, ECs, et des PGCs d’une part, l’ICM et l’Epi d’autre part (Voir chapitre 1.2). Une étude plus approfondie du développement embryonnaire et des mESCs nous permet aujourd’hui de détailler ce propos.

• Origine et établissement de l’état naïf de pluripotence

Une étude réalisée en 1997 avait montré que l’efficacité de dérivation de lignées de mESCs était fortement augmentée si on utilisait l’épiblaste du blastocyste péri-implantatoire (E4.5) au lieu de l’ICM du blastocyste à E3.5 (Brook and Gardner, 1997). L’efficacité observée avec l’épibaste E4.5 peut atteindre près de 100%. On peut penser que l’épiblaste de l’embryon E4.5 est le véritable tissu fondateur des cellules mESCs. Nous verrons plus loin que l’analyse de signature moléculaire des cellules soutient cette hypothèse. On a également montré que seul un petit nombre de cellules participe à l’établissement d’une lignée (Buehr et al., 2003). La majorité des cellules perdent l’expression de Oct4 après quelques jours en culture. Cette observation soulève la question suivante : est ce que cette minorité de cellules suit un programme particulier lui permettant de se maintenir en culture ?

Pour répondre à cette question, Tang et collaborateurs ont analysé le transcriptome des cellules de l’ICM (E3,5), de l’épiblaste (E4,5) à l’échelle unicellulaire par la technique de "single-cell RNA seq", puis l’ont comparé à celui de mESC en culture (Tang et al., 2010). Ils ont montré que, durant la dérivation en milieu FBS/LIF, des changements importants s’opéraient et que les cellules suivaient un programme commun. Les gènes Ifitm3, Blimp1, Prdm14, et Vasa, dont l’expression est associée à l’engagement précoce dans le lignage germinal, étaient fortement activés durant les premières phases de la dérivation. Ils proposent que les cellules de l’ICM passent par un état transitoire ressemblant à celui des PGCs avant de se stabiliser en cellules mESC in vitro (Tang et al., 2010) (Figure 19A). Chu et collaborateurs ont approfondi cette question en étudiant les mécanismes moléculaires mis en place lors de l’établissement des lignées de cellules ES en culture (Chu et al., 2011). Ils se sont intéressés à l’expression du facteur de transcription Blimp1 (Prdm1) qui est essentiel à la formation des PGCs lors du développement embryonnaire (Vincent et al., 2005). Ils ont utilisé un système

"rapporteur", composé de la recombinase Cre sous contrôle du promoteur Blimp1 et d’une protéine fluorescente RFP-stop-"floxée" sous contrôle du promoteur Rosa26. L’expression de la RFP permet de détecter l’activité transitoire du gène Blimp1 dans les cellules. En utilisant ce système d’expression ils ont observé que, parmi les cellules participant à l’établissement des lignées de mESCs, 80% avaient activé Blimp1. De plus, une analyse à l’échelle unicellulaire de l’expression génique a révélé que l’expression de Blimp1 était associée à d’autres marqueurs spécifiques des PGCs comme Lin28, Stella, Iftim3, Prdm14 et c-Kit (Chu et al., 2011). Ces résultats indiquent que la majorité des cellules de l’ICM passeraient par un état transitoire "PGCs-like" avant de devenir des cellules mESC.

Une fois les lignées établies, on sait qu’à l’état naïf, les cellules fluctuent entre l’état fondamental et l’état d’engagement. Y a t-il une relation entre les différentes sous-populations des cellules et les différents états de développement de l’épiblaste dans l’embryon ? Nous savons que, sur la base de leur profil d’expression génique et de modifications épigénétiques, les cellules positives pour l’expression de Rex1 ou Stella sont plus proches de l’ICM/épiblaste précoce (E3,5-4,5), alors que les cellules négatives pour l’expression de ces deux gènes sont plus proches de l’épiblaste précoce/tardif (E4,5-5,5) (Hayashi et al., 2008; Toyooka et al.,

2008). Ces observations conduisent à l’idée que, dans l’état naïf, les différentes

sous-populations de cellules correspondraient à différents stades du développement embryonnaire. En résumé, les cellules de l’épiblaste précoce seraient à l’origine des mESCs dont la stabilisation en culture passe par un état transitoire PGCs-like. Une fois en culture, les cellules fluctuent entre différents états plus ou moins avancés, proches des stades de l’épiblaste préimplantatoire.

Figure 19 : Origine embryonnaire des mESCs.

(A) Dérivation de lignées de mESCs en conditions FBS/LIF, à partir d’embryons au stade blastocyste (E3,5/E4,5). La majorité des cellules participant à l’établissement des lignées passent par un état transitoire "PGC-like" où elles activent des marqueurs spécifiques des PGCs. (B) Dérivation en conditions 2i/LIF où seul l’épiblaste tardif de blastocystes préimplantatoire (E4-4,5) permet l’obtention de lignées de mESCs. Le milieu 2i/LIF permet une "capture directe" de l’état de l’épiblaste. Les photographies d’embryons sont adaptées de (boroviak et al., 2014)

mESCs

E1,5 E2,5 E3,5 E4,0 E4,5 E5,5 2-cellules 8-cellules ^Blastocyste _précoce Blastocyste ^Blastocyste _tardif Epiblaste

E1,5 E2,5 E3,5 E4,0 E4,5 E5,5 2-cellules 8-cellules ^Blastocyste _précoce Blastocyste ^Blastocyste _tardif Epiblaste

Etat transitoire "PGC-like"

Etat Naïf Dérivation FBS/LIF Dérivation 2i/LIF Etat Fondamental

(Etat de l’épiblaste E4,0-4,5)

mESCs mESCs "Capture directe"

A)

B)

Lin28+, Stella+, Iftim3+, Prdm14+ et c-Kit+

Blimp1-

• Origine et établissement de l’état fondamental de pluripotence

Nous avons vu précédemment que les milieux de culture 2i et 3i sont capables de stabiliser les mESCs à l’état naïf dans un état de pluripotence appelé état fondamental. Nous avons aussi vu que l’établissement des lignées passe par un état dit "PGC-like" caractérisé par l’expression transitoire de Blimp1 (Chu et al., 2011). En utilisant le milieu 2i/3i, les mêmes auteurs ont montré que les cellules qui n’ont jamais activé Blimp1 peuvent produire des lignées de cellules mESC avec une efficacité 20 fois supérieure qu’en conditions standard (FBS/LIF). Ces observations peuvent être interprétées de la manière suivante : le milieu 2i/3i permet de contourner la transition Epi  mESC par l’état "PGC-like" et autorise une capture directe de l’état fondamental de pluripotence qui caractérise l’épiblaste précoce.

L’idée selon laquelle le milieu 2i/3i capture un état fondamental de pluripotence qui pré-existe dans l’épiblaste est renforcée par l’étude de l’embryon de souris en culture. Lorsque des morula/blastocystes sont cultivés dans le milieu 2i/3i, la formation du PrE est bloquée et toutes les cellules de l’ICM forment l’épiblaste (Nichols et al., 2009a). Un autre argument tient à la nature mono- ou bi-allélique de l’expression du gène Nanog. Nanog possède une expression mono-allélique durant les premières étapes du développement pré-implantatoire. Son expression devient progressivement bi-allélique dans les cellules de l’ICM et de l’épiblaste précoce représentant l’état fondamental de pluripotence (Miyanari and Torres-Padilla, 2012). L’expression de Nanog redevient mono-allélique dans l’épiblaste tardif (post-implantatoire). Or, on a observé que l’expression de Nanog est bi-allélique en milieu 2i/LIF et mono-allélique en milieu FBS/LIF (Miyanari and Torres-Padilla, 2012). Ces données renforcent l’idée que le milieu 2i permet une capture de l’état fondamental de pluripotence qui est l’état de pluripotence de l’épiblaste précoce in vivo.

Tous les arguments apportés jusqu’à maintenant pour soutenir l’origine embryonnaire de l’état fondamental de pluripotence sont des arguments indirects. Une étude très récente a tenté de répondre plus directement à la question de l’origine embryonnaire des mESCs dans l’état fondamental de pluripotence (Boroviak et al., 2014). Pour cela, les auteurs ont dérivé des lignées de mESCs à partir de cellules uniques de l’ICM d’embryons à différents stades de développement (E2,25-2,5 / E3,25-E3,5 / E3,75-E4,0 / E4,25-E4,5) (Boroviak et al., 2014). En cultivant les cellules dans le milieu 2i/LIF, ils ont observé une meilleure efficacité de dérivation à partir des embryons entre E3,75 et E4,5, ce qui coïncide avec le stade de la formation de l’épiblaste (Figure 19B). De plus, en utilisant un substrat proche de la matrice extracellulaire du

blastocyste (Fibronectine + Laminine 511), ils ont observé que quasiment toutes les cellules de l’épiblaste avaient la capacité de produire une lignée de mESC (Boroviak et al., 2014).

L’analyse par "single-cell qPCR" de l’expression de 96 marqueurs de pluripotence dans les cellules de l’embryon et dans les lignées cultivées en 2i/LIF a confirmé que la signature moléculaire des mESCs était plus proche de celle des cellules de l’épiblaste (E4,5) que de celle des cellules de l’ICM. De plus, cette signature moléculaire est stable au cours du processus de dérivation des lignées. L’ensemble de ces résultats démontre que le milieu 2i/LIF permet la capture directe, stable et irréversible de l’état de pluripotence de l’épiblaste in vitro.

En résumé, lors de la dérivation des mESC en milieu FBS/LIF, les cellules de l’ICM ou de l’épiblaste précoce passent par un état transitoire "PGC-like" avant de se stabiliser à l’état naïf. Les lignées fluctuent spontanément entre l’état fondamental de pluripotence et l’état d’engagement, créant une fenêtre favorable à la différenciation. Le milieu 2i/LIF est capable de capturer directement l’état fondamental de pluripotence. Les mESCs sont alors l’équivalent in

vitro des cellules de l’épiblaste précoce (Figure 19).

4.1.4. Caractéristiques moléculaires