A quel niveau de pluripotence sont stabilisées les PSCs de lapin

1.3.1. Les RbESCs et RbiPSCs

En comparaison avec les RbESCs, les RbiPSCs surexpriment certains marqueurs de la pluripotence naïve (Cdh1, Essrb, Klf4, Pecam1, Piwil2 et Dazl). Cependant, ce niveau d’expression reste plus faible que celui des cellules de l’ICM (1/10ème à 1/100ème), qui servent ici de référence de l’état naïf chez le lapin (Osteil et al., 2013). De plus, les RbiPSCs n’expriment pas d’autres marqueurs naïfs comme Rex1, Tbx3, Gbx2 et Fgf4. Ces résultats obtenus au laboratoire par RT-qPCR sont confirmés par l’analyse globale du transcriptome

(Schmaltz-Panneau et al., 2014).

En plus des RbPSCs, nous avons analysé le transcriptome de l’ICM de blastocyste précoce à E3,5 ainsi que l’épiblaste d’embryons au stade pré-gastrula E6. La comparaison des transcriptomes montre une ségrégation forte entre les cellules in vitro (RbESCs et RbiPSCs) et

in vivo (ICM et Epi). Cette analyse permet de différencier les RbiPSCs et les RbESCs,

cependant aucun des deux types cellulaires n’apparaît plus proche des cellules de l’embryon. En se basant sur l’analyse de différents groupes fonctionnels de gènes, il ressort que par rapport aux cellules in vivo, les cellules in vitro :

(i) sous-expriment de nombreux marqueurs de pluripotence comme Tet1/2, Prdm14,

Esrrb, Tbx3, Rex1, Rif1, Dppa2, Kdmac.

(ii) surexpriment des gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire et plus particulièrement dans la transition G1/S (Cdkn1/p21)

(iii) surexpriment des gènes impliqués dans la différenciation (Wnt5a, Lef1, Tcf4) et le développement embryonnaire (Hox, T, Ptx2).

Ces résultats sont cohérents avec l’observation d’une phase G1 des RbPSCs plus longue que chez les cellules amorcées d’autres espèces (hESCs et RhESCs). De plus, la surexpression des gènes impliqués dans la transition G1/S est en adéquation avec le fait qu’une partie de la population de RbPSCs présente un point de contrôle en G1 en réponse aux dommages à l’ADN. On peut préciser que ces gènes sont exprimés à un niveau supérieur dans les RbESCs par rapport aux RbiPSCs. Ceci est cohérent avec la plus forte proportion de RbESCs présentant un point de contrôle en G1.

La surexpression des gènes de développement ainsi que la sous expression de certains gènes de pluripotence sont des arguments permettant d’expliquer l’incapacité des RbPSCs à coloniser efficacement le blastocyste. L’ensemble de cette analyse transcriptomique permet de conclure que les PSCs de lapin apparaissent comme amorcées voire proches de l’engagement vers la différenciation. Malgré tout, cette conclusion n’est pas en contradiction avec les observations faites au laboratoire. Cela suggère que les différences observées en RT-qPCR sur les marqueurs spécifiques discriminant l’état naïf et amorcé restent pertinentes mais sont minimes et diluées dans l’ensemble des données transcriptomiques.

1.3.2. Les cellules EK

Les cellules EK ("enhanced" KLFs) ont été obtenues par la surexpression des gènes

hKLF2 et hKLF4 dans la lignée RbiPSCs B19EOS. Les cellules EKs sont cultivées dans un

milieu supplémenté de 10% FBS + LIF (S10L). Bien que cultivées en présence de LIF et en absence de FGF, les cellules EK-S10L restent dépendantes des voies Activine/FGF. Elles sont cultivées en présence de MEF, connues pour sécréter de l’Activine et du FGF (Bendall et al., 2007; Greber et al., 2007b). L’absence de cellules nourricières conduit à la différenciation des cellules EK-S10L, suggérant que la production d’Activine/FGF par les MEF soutient leur autorenouvellement. On peut noter que les RbiPSCs B19EOS ne se maintiennent pas plus de 10 passages dans les conditions FBS/LIF et ce, même en présence de cellules nourricières. Cela indique que la concentration de facteurs de croissance requise pour soutenir l’autorenouvellement des cellules EKs doit être inférieure à celle nécessaire aux RbiPSCs B19EOS.

Contrairement aux ESCs de souris, les cellules EKs se sont révélées incapables de proliférer de façon stable en présence des 2i. Toutefois des différences notables ont été observées entre lignées. Ainsi les lignées ne surexprimant pas ou peu KLF2 et KLF4 se sont différenciées en moins de 3 passages. Les lignées exprimant fortement les KLFs ont pu proliférer jusqu’à 10 passages en KOSR-2i et 5 passages en conditions N2B27-2i/LIF.

Cette observation conforte l’hypothèse que les lignées exprimant le plus haut niveau de KLFs sont plus proches de l’état naïf. Cependant, au vu de la morphologie des cellules, ces conditions de cultures semblent induire la différenciation des cellules dans la voie neurectodermique (Figure 26). Ce constat est cohérent avec les observations faites chez le primate, où la condition 2i/LIF semble induire la différenciation des PSCs en neurectoderme

(Fang et al., 2014; Hirano et al., 2012; Li et al., 2011a; Theunissen et al., 2014; Ware et al.,

2014).

Figure 26 : La culture des cellules EKs dans les conditions 2i/LIF

Photographies représentant la lignée EK9 après 9 passages en condition KORS-2i/LIF et 5 passages dans les conditions N2B27-2i/LIF.

• Les caractéristiques moléculaires

La surexpression des gènes KLF2 et KLF4 associée à la culture en condition FBS/LIF a permis de réverter les RbiPSCs B19EOS vers l’état naïf de pluripotence. En comparaison au B19EOS, les cellules EK-S10L surexpriment de nombreux marqueurs spécifiques de l’état naïf comme Nanog, Esrrb, Rex1, Piwil2, Dazl, Tbx3, FGF4, Cdh1, Dppa2 et Dppa5. L’expression de certains gènes se rapproche également du niveau d’expression de l’ICM. C’est le cas des marqueurs naïfs Pecam1 et Gbx2 dont l’expression diminue ainsi que des marqueurs amorcés

Otx2, Pitx2 dont l’expression augmente. Cette observation suggère qu’il peut exister des

différences dans les marqueurs discriminant l’état naïf et amorcé entre espèces. Enfin, contrairement aux PSCs KOSR/FGF, le niveau d’expression de la majorité des marqueurs est proche du niveau d’expression de l’ICM (d’un facteur 1 à un facteur 10).

Chez la souris, Klf4 et Klf2 activent directement l’expression de Nanog et Esrrb (Jiang et

al., 2008). Dans les cellules EKs, Nanog et Esrrb sont surexprimés dans les cellules ayant la

plus forte expression des transgènes KLF2/KLF4. Ce résultat suggère que certaines cibles des Klfs sont conservées entre la souris et le lapin. On peut noter que Fbxo15 est également une

EK9

cible directe des Klfs chez la souris (Jiang et al., 2008). Cependant son expression ne fluctue pas chez le lapin, suggérant que toutes les cibles ne sont pas conservées entre ces deux espèces.

L’analyse globale du transcriptome montre que les cellules EK-S10L forment un cluster différent des RbiPSCs, indiquant un changement majeur de leur transcriptome. De plus, le clustering hiérarchique de corrélation ainsi que l’axe 1 de l’ACI montrent que les cellules EK-S10L sont plus proches des cellules de l’embryon que des RbiPSCs avant réversion.

L’ensemble de ces résultats permet de conclure que les cellules EK-S10L sont différentes des RbiPSCs et plus proches de l’état des cellules de l’embryon. En adéquation avec ces changements moléculaires, les cellules EKs présentent également des caractéristiques fonctionnelles propres à l’état naïf de pluripotence comme une augmentation du potentiel de colonisation de l’embryon préimplantatoire.