FGF + Activine
5. Le lapin comme modèle d’étude de la pluripotence
• Le lapin : un modèle intéressant
En considérant le développement embryonnaire précoce et donc par extension des PSCs, la souris semble être l’exception et non la règle. En effet, les études récentes traitant du développement embryonnaire précoce des autres espèces comme l’homme, le porc et le bovin ont observé des différences notables dans les mécanismes de mise en place des premiers lignages. Il en découle que l’étude de la pluripotence chez l’homme n’est pas forcément bien modélisée par la souris.
Le lapin apparaît ici comme un modèle d’étude intéressant. Il est phylogénétiquement plus proche de l’homme que la souris (Graur et al., 1996). De plus, bien que peu de données soient disponibles concernant le développement embryonnaire précoce, il semblerait que le lapin suive une régulation et une cinétique d’expression des gènes proches des autres espèces et différentes de la souris. Par exemple, à l’inverse de la souris on retrouve l’expression du gène
Oct4 dans les cellules de l’ICM et du TE jusqu’au stade blastocyste tardif comme c’est le cas
chez le porc, le bovin et l’homme (Cauffman et al., 2005; van Eijk et al., 1999; Kirchhof et al., 2000; Kuijk et al., 2012).
De plus, l’étude des différents états de pluripotence nécessite la possibilité de tester la capacité de formation de chimères, ce qui est impossible chez l’homme. En comparaison du bovin et du porc, le lapin présente l’avantage d’être un petit animal à faible coût d’élevage. De plus, l’obtention d’un grand nombre d’embryons n’est pas une limitation chez le lapin en comparaison des autres espèces. Par exemple, Rodriguez et al. ont testé le rôle de différentes voies de signalisation chez l’embryon de porc (Rodriguez, 2012). Cependant, le faible nombre d’embryons obtenu, n’a pas permis de démontrer statistiquement l’effet de certains traitements. Chez le lapin, on peut obtenir 35 embryons en moyenne par lapine (116 maximum au laboratoire). Cela permettrait de tester facilement la capacité de colonisation des cellules.
• Les cellules souches pluripotentes chez le lapin
Le lapin est déjà un modèle d’étude de nombreuses maladies humaines comme athérosclérose ou les maladies cardio-vasculaires (Duranthon et al., 2012). L’obtention de cellules de lapin possédant les mêmes caractéristiques que les mESCs permettrait de développer les techniques de transgénèse et faire du lapin un outil pertinent pour la recherche fondamentale et médicale.
Cependant, très peu d’études ont rapporté l’obtention de cellules pluripotentes chez le lapin
(Fang et al., 2006; Honda et al., 2008, 2009, 2013; Wang et al., 2007). De par leurs
caractéristiques, les cellules de lapin peuvent être classées parmi les cellules amorcées. Généralement, les cellules obtenues sont dépendantes de la voie FGF/Activine. De plus, elles ne semblent pas capables de coloniser efficacement l’embryon de lapin. Par ailleurs, la pluripotence chez le lapin est mal définie et aucune caractérisation poussée n’a été réalisée sur les PSCs de lapin. On peut également préciser que l’obtention de lignées d’iPSCs de lapin n’avait pas encore été rapportée lors du début de mon projet de thèse. Enfin, aucune caractérisation visant à définir l’état de pluripotence n’a été apportée chez le lapin. De plus, la réversion de RbPSCs à l’état naïf de pluripotence n’a pas été réellement étudiée. En effet, une seule équipe a présenté la réversion de PSCs de lapin (Honda et al., 2013; Kimiko et al., 2014). Toutefois, aucune caractérisation de ces cellules n’a été apportée. Il en ressort plusieurs interrogations :
Qu’elles sont les caractéristiques moléculaires et fonctionnelles des PSCs de lapin ? Est-il possible de réverter les PSCs de lapin à vers l’état naïf de pluripotence ? Qu’elles sont les caractéristiques des cellules "naïves" chez le lapin ?
Est ce que le LIF peut promouvoir la pluripotence chez le lapin ?
Est que ces cellules ainsi produites ont la capacité à coloniser l’embryon ?
Dans le but d’apporter des réponses à ces questions, j’ai d’abord entrepris de fabriquer et caractériser des lignées de cellules iPSCs de lapin. Ainsi 3 lignées de RbiPSCs dépendantes du FGF2 ont été obtenues par reprogrammation de fibroblastes grâce à la surexpression des transgènes humains OCT4, SOX2, KLF4, et c-MYC. La caractérisation moléculaire et fonctionnelle de ces lignées, en comparaison à 4 lignées de RbESCs dérivées au laboratoire, a fait l’objet d’une publication (Osteil et al., 2013).
La caractérisation de ces lignées d’iPSCs a révélé que bien que possédant certaines caractéristiques propres aux cellules naïves, les RbiPSCs sont incapables de coloniser efficacement l’embryon. C’est pourquoi j’ai ensuite entrepris de réverter les cellules RbiPSCs vers l’état naïf de pluripotence. En se basant sur les études traitant de la réversion chez la souris et l’homme, nous avons choisi de surexprimer de façon stable les transgènes humains KLF2 et
KLF4. Les deux lignées obtenues appelées EKs, montrent une signature moléculaire plus
proche de l’état de l’embryon ainsi qu’une capacité accrue à la colonisation de l’ICM d’embryon au stade blastocyste. La caractérisation moléculaire et fonctionnelle des cellules EKs fait l’objet d’une deuxième publication en cours de soumission.
RESULTATS
« Il ne suffit pas de dire : je me suis trompé ;
il faut dire comment on s’est trompé. »
Claude Bernard (1813-1878)
RESULTATS
Introduction
Les premières lignées de ESCs obtenues chez le lapin semblent stabilisées à l’état amorcé de pluripotence, comme en témoignent leur dépendance aux voies FGF/Activine ainsi que leur incapacité à coloniser l’embryon préimplantatoire de lapin (Fang et al., 2006; Honda et al.,
2008; Wang et al., 2007). Ces différentes études montrent que les RbESCs possèdent bien
toutes les caractéristiques cardinales de cellules pluripotentes, cependant aucune étude n’a précisément étudié le statut de pluripotence, ni définit les caractéristiques liées à l’état de pluripotence chez cette espèce. Dans ce cadre, mon travail de thèse a eu pour but d’étudier et de définir les états de pluripotence chez le lapin en se basant sur des propriétés permettant de discriminer les états naïf et amorcé définis chez d’autres espèces. Outre la question fondamentale liée à l’étude des états de pluripotence, une des motivations principales est d’obtenir des lignées cellulaires capables de coloniser l’embryon en vue de générer des chimères et ainsi développer les techniques de transgénèse chez le lapin.
Ce chapitre est divisé en 2 sous parties, la première décrira les travaux qui ont permis d’aboutir à l’obtention et à la caractérisation de trois lignées RbiPSCs, en comparaison à quatre lignées de RbESCs. Seront également présentées une analyse globale du transcriptome de l’ICM et de l’épiblaste tardif de lapin et leur comparaison avec les différentes lignées de PSCs obtenues au laboratoire. Enfin la seconde partie regroupera les travaux visant à réverter les RbiPSCs vers l’état naïf de pluripotence.