Finalement, conformément au protocole commercial, après trois lavages de 1 mg de billes en PBS, 20 µg d’anticorps biotinylés leur sont ajoutés et l’ensemble est incubé sous agitation à température ambiante durant 30 minutes. Les billes sont ensuite saturées et stockées en PBS 0.1% de BSA à 4oC jusqu’à utilisation.
4.1.4 Préparation de sérum et de plasma de lapin
Les tests médicaux sont couramment réalisés avec du plasma ou du sérum humain. N’ayant pas l’autorisa- tion de manipuler ces échantillons humains au laboratoire, et afin de tester notre outil de diagnostic avec des matrices biologiques s’en rapprochant, du sérum et du plasma de lapin ont été préparés.
Sérum de lapin
Le sang, (environ 40 mL) collecté dans un bécher en verre à l’animalerie d’un lapin « naïf » (auquel aucun produit n’a préalablement été administré), est laissé à coaguler autour d’une pipette en verre pendant 30 minutes à température ambiante puis pendant une nuit à 4oC. Le coagulat est retiré et la solution restante est centrifugée 15 minutes à 2000 g. Le surnageant est récupéré et réparti en aliquots de 5 mL stockés à -20oC jusqu’à utilisation.
Plasma de lapin
Le sang (environ 40 mL) est collecté à l’animalerie d’un lapin naïf dans un tube Falcon de 50 mL contenant de l’Éthylènediaminetétraacétique (EDTA) ou de l’héparine. Il est immédiatement centrifugé 15 minutes à 2000 g à 4oC. Le surnageant est récupéré et réparti en aliquots de 5 mL stockés à -20oC jusqu’à utilisation.
4.2
Optimisations du laboratoire sur puce
Avant de réaliser les expériences complètes elles-mêmes, divers paramètres ont dû être optimisés. Ces étapes préliminaires, résumées dans le Tableau 4.1, ont permis de définir les laboratoires sur puce les plus susceptibles de donner les résultats souhaités.
Paramètre Valeurs testées Conclusions
Réservoir Fluigent (aspiration par le haut)/ Réservoir vertical Réservoir vertical (aspiration par le bas) plus adapté
Pression
50 mbar Un flux trop lent
100 mbar favorise
150 mbar le bouchage
Agitation
Aucune Faible efficacité et
Rotation du tube diminution de
Moteur dans le réservoir la survie des cellules
Lavage eau DI Toujours des cellules après 20 minutes,
PBS aucune influence
Tapissage puce Non Aucune influence
Tapissage PBS+ 1% BSA (4 h)
Tableau 4.1 –Tests réalisés dans des puces de 1 mm de large avec des échantillons de 105NS1/mL par observations avec une caméra rapide. L’influence du type de réservoir, de la pression appliquée et de l’agitation sont évaluées par le nombre de cellules passant devant la caméra en un temps donné tandis que le lavage et le tapissage (saturation) par la BSA (censé rendre les parois moins adhérentes [110]) sont évalués par la présence de cellules après un lavage de 20 minutes.
4.2.1 Système fluidique
Au début de ma thèse, les échantillons étaient introduits dans le réservoir Fluigent qui aspire le liquide par le haut. La pression était réglée aux alentours de 100 mbar, le canal avait une hauteur de 35 à 50 µm et l’aimant permanent utilisé (Aimant initial) était un aimant néodyme-fer-bore cylindrique de diamètre 6 cm et d’épaisseur 5 mm. Le champ en son centre a une intensité de 93 mT mais varie entre 82 et 110 mT dans un volume de 2 cm3. Le montage initial est schématisé Fig.4.6 A. Les bouchages de puce n’étaient pas rares et toutes les cellules n’étaient pas récupérées en sortie du canal (comme nous avons pu nous en apercevoir en comptant, sur cellule de Malassez, les cellules à l’entrée et à la sortie du canal).
Le passage des cellules seules dans différentes puces de 1 mm de large a été observé grâce à un microscope optique au grossissement 5X couplé à une caméra rapide (100 images/s, Dalsa PT-41-04M60). Les tests réalisés dans cette configuration sont résumés dans le Tableau 4.1.
4.2.2 Aimant et hauteur des canaux
D’autres tests d’écoulements ont été réalisés sur des échantillons contenant 105 NS1/mL et 23 µg de billes/mL dans des puces avec des canaux de largeur 100 µm et de hauteurs variées placées sur des aimants différents. Le comptage du nombre de cellules en sortie de l’écoulement et l’observation du réservoir d’entrée de la puce après écoulement ont permis d’évaluer la meilleure configuration. Les tests effectués sont résumés dans le Tableau 4.2. Ces tests ont permis de déterminer les deux causes de bouchage :
— des canaux trop bas,
— un gradient de champ élevé, menant à l’accumulation des objets magnétiques dans une même zone du canal.
Hauteur du canal Aimant utilisé Bouchage Accumulation de cellules dans le réservoir
21 µm Aucun Fréquent Non
24, 34 et 46 µm Aucun Rare Non
24 µm Aimant initial Fréquent Importante
46 µm Aimant initial Rare Importante
24 µm Aimant homogène Rare Faible
46 µm Aimant homogène Rare Faible
Tableau 4.2 –Tests réalisés dans des puces de 100 µm de large avec des échantillons positifs à 105NS1/mL et 23 µg de
billes/mL. Le comptage du nombre de cellules en sortie de l’écoulement et l’observation du réservoir d’entrée de la puce
permettent de tirer des conclusions pour chaque condition.
4.2.3 Conclusions des expériences préliminaires
Tenant compte des résultats de ces deux études, un réservoir fluidique vertical sans raccord a alors été mis au point dans un matériau peu adhérent, le polyoxyméthylène. La pression imposée a été fixée au maximum des capacités du contrôleur de pression, c’est-à-dire à 300 mbar. Un dispositif (nommé ensuite aimant homogène) contenant deux aimants et deux plaques de µ-métal formant une zone de champ homogène au centre de la structure est utilisé. La mesure avec un Gaussmètre a permis d’évaluer que le champ dans un volume de 2 cm3 autour du centre de la structure varie entre 88 et 89 mT. L’ensemble de l’échantillon liquide se trouve dans cette zone de champ très homogène. Le dispositif de champ homogène a alors été percé pour permettre l’introduction du réservoir fluidique dans cette zone et son chargement maximum a été défini à 400 µL. Le système final est présenté Fig.4.6 B. Les canaux microfluidiques de 25 µm de haut sont suffisants avec ce nouveau montage pour éviter les bouchages.
4.2. OPTIMISATIONS DU LABORATOIRE SUR PUCE 61 A Champ homogène Pression appliquée B Pression appliquée 50 µm B C
Temps écoulé depuis le début de l’expérience (s)
Fr ac tion d e sign au x en re gis tr és I II III 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 50 100 150 200 250
Figure 4.6 –Evolution du montage de l’expérience. A) Montage initial avec réservoir Fluigent, aspirant l’échantillon par le haut, et aimant permanent inhomogène placé sous le capteur. Après passage d’un échantillon, certaines cellules restent au fond du réservoir et d’autres sont bloquées dans l’entrée de la puce, zone de ralentissement fluidique et soumise à un fort gradient magnétique. B) Nouveau montage. Le réservoir a été « fait maison » pour ne présenter aucun raccord ni aucun rebord. Il est de plus inclus, ainsi que la puce microfluidique, dans un montage comprenant 2 aimants et deux plaques en µ-métal créant un champ homogène sur tout un volume en son centre. Le réservoir ne doit pas être rempli à plus de 400 µL afin d’éviter de sortir de cette zone de champ homogène. C) Avec ce nouveau dispositif, toutes les cellules sont récupérées à la sortie mais leur passage au-dessus du capteur n’est absolument pas régulier dans le temps. Dans un premier temps, le passage d’objets est régulier, ensuite, durant la phase la plus longue, il ne passe quasiment plus aucun
objet devant le capteur, enfin, les quelques derniers microlitres emportent une grande quantité de cellules (et/ou de billes).
Quelques expériences de vérification ont été réalisées afin d’évaluer la répercussion du nouveau montage sur le passage des cellules. Un échantillon de 300 µL à 105cellules NS1/mL et 23 µg/mL de Dyna1 fonction- nalisées par l’anticorps anti-CD138 (Dyna1-anti-CD138) et un échantillon de 300 µL à 105cellules NS1/mL et 23 µg/mL de Dyna1 fonctionnalisées par l’anticorps IpaD315 (Dyna1-IpaD315) ont été passés dans le nouveau système (hauteur de canal de 36 µm) et la concentration en cellules du liquide collecté en sortie a été évaluée par comptage sur cellule de Malassez et trouvée très proche de la concentration initiale (moins de 25% de variation). D’autre part, une deuxième expérience a été réalisée enregistrant les signaux obtenus sur le passage d’un échantillon de 200 µL à 105cellules NS1/mL et 23 µg/mL de Dyna1 fonctionnalisées par l’anticorps anti- CD138 dans une puce de 26.5 µm de haut. L’enregistrement des signaux (Fig.4.6 C) a révélé que le passage des objets dans le canal au cours du temps est loin d’être linéaire. Ce phénomène peut être compris ainsi :
— (I) Les cellules passent régulièrement dans le canal, avec une concentration supérieure à la concentration nominale due à la géométrie verticale du réservoir et au phénomène de sédimentation des cellules. Donc, bien avant que le liquide ne soit totalement passé, la concentration en cellules chute jusqu’à être quasi- nulle dans le réservoir d’entrée.
— (II) Très peu de signaux sont comptés jusqu’à la quasi-fin du passage de l’échantillon.
— (III) Aux derniers microlitres de liquide, les cellules qui avaient tapissé l’intérieur du réservoir se font arracher des parois par la tension de surface et, brusquement le nombre de signaux comptés par seconde atteint son maximum.
Ce manque de régularité a de nombreux inconvénients comme la génération de longues plages de temps sans aucun signal attestant du bon déroulement de l’expérience ou le chevauchement des derniers signaux les rendant beaucoup plus difficiles à dénombrer précisément. Cependant, aucun autre système testé n’a permis de passer l’ensemble des cellules d’un échantillon. Des améliorations possibles seront discutées dans les perspectives.
4.2.4 Plan d’expériences
Toutes les conditions sont réunies pour réaliser et tester la puce GMR. Pour l’évaluer en tant qu’outil de diagnostic cependant, un protocole d’expériences soigné doit être mis en place.
Dans un premier temps, plusieurs expériences sont réalisées avec les trois mêmes échantillons, choisis pour évaluer la spécificité du test :
— 105NS1+ 23 µg de Dyna1-anti-CD138 dans 1 mL de PBS
— 105NS1+ 23 µg de Dyna1-IpaD315 dans 1 mL de PBS (contrôle négatif 1) — 23 µg de Dyna1-anti-CD138 dans 1 mL de PBS (contrôle négatif 2)
La concentration de 105 NS1/mL est justifiée par deux raisons : i) tous les tests de labélisation ont été me- nés à cette concentration, c’est donc un échantillon bien connu, ii) c’est aussi une concentration assez élevée qui permet à la fois un contrôle visuel très simple de leur labélisation par les billes magnétiques et une dif- férence nette entre les échantillons positifs et négatifs. Les deux contrôles négatifs différents sont également indispensables. En effet, le premier consiste à vérifier que les billes se lient bien aux cellules spécifiquement par l’anticorps anti-CD138 et non à cause d’une liaison non spécifique, indépendante de l’interaction épitope (à la surface de la protéine CD138 cible)/ paratope (porté par l’anticorps), liaison qui serait visualisée avec les billes portant l’anticorps IpaD315. Le second contrôle vérifie que les billes utilisées pour l’échantillon positif ne créent pas par elles-mêmes, en absence de cellules, les signaux repérés pour l’échantillon positif. Ainsi par ces trois tests, répétés au moins trois fois, la spécificité peut être attestée si une différence notable est obser- vée entre l’échantillon positif et les deux échantillons négatifs. Si aucune différence n’est observée, alors cela signifie que les signaux observés ne sont pas spécifiques de l’interaction anticorps anti-CD138/ cellules NS1. Les étapes préliminaires sont alors à reprendre.
Une fois cette validation de la spécificité du test réussie, des expériences sont menées pour déterminer une limite de sensibilité du test dans les mêmes conditions. Les échantillons sont préparés avec des dilutions de cellules de 3 en 3 à partir de la concentration initiale (105 cellules/mL) jusqu’à une concentration menant à l’échec du test (non détectabilité des cellules labélisées). Les échantillons contrôle doivent également être passés à chaque expérience. Un contrôle négatif supplémentaire peut être ajouté pour vérifier que les billes fonctionnalisées avec l’anticorps spécifique des cibles ne se lient pas à d’autres lignées cellulaires. Les cellules Ovariennes de Hamster Chinois (CHO pour « Chinese Hamster Ovary cells » en anglais) ont été sélectionnées pour ce rôle car elles ne possèdent pas l’antigène cible CD138, et elles présentent l’avantage d’être très faciles à cultiver. Toutes ces expériences doivent être répétées au moins trois fois pour pouvoir mener à une conclusion. Finalement, selon les expériences nous avons utilisé 8 échantillons :
— 105NS1+ 23 µg de Dyna1-anti-CD138 dans 1 mL de PBS — 3 104NS1+ 23 µg de Dyna1-anti-CD138 dans 1 mL de PBS — 104NS1+ 23 µg de Dyna1-anti-CD138 dans 1 mL de PBS — 3 103NS1+ 23 µg de Dyna1-anti-CD138 dans 1 mL de PBS — 103NS1+ 23 µg de Dyna1-anti-CD138 dans 1 mL de PBS
— 105NS1+ 23 µg de Dyna1-IpaD315 dans 1 mL de PBS (contrôle négatif 1) — 23 µg de Dyna1-anti-CD138 dans 1 mL de PBS (contrôle négatif 2)
— 105CHO+ 23 µg de Dyna1-CD138 dans 1 mL de PBS (contrôle négatif 3)