4.3.1 Préparation des échantillons
Préparation des cellules NS1
Quelques heures avant une expérience, les suspensions de cellules en culture sont récupérées puis centrifu- gées (10 min, 1000 RPM avec un rayon de 17.2 mm à 9oC) et reprises dans le milieu souhaité préalablement chauffé à 37oC (les expériences ont principalement été réalisées en PBS et en 20% PBS 80% plasma de lapin). Leur dénombrement est ensuite effectué de trois façons différentes et la concentration est déterminée comme la moyenne de ces trois résultats :
— les cellules sont diluées au centième et dénombrées au compteur de cellules TC20, — les cellules sont diluées au centième et comptées sur cellule de Malassez,
4.3. DÉROULÉ D’UNE EXPÉRIENCE 63
Préparation des cellules CHO
Les cellules CHO sont lavées deux fois en PBS. Ensuite, 2 mL de trypsine-EDTA à 0.25% leur sont ajoutées et elles sont remises à 37oC pendant 2 minutes. Après vérification au microscope de leur décollement du fond de la boite de culture (cellules adhérentes), elles sont diluées dans 7 mL de milieu de culture et centrifugées (5 min, 1500 RPM avec un rayon de 17.2 mm à 4oC). Elles sont ensuite reprises dans le milieu souhaité préalablement chauffé à 37oC et dénombrées au compteur de cellules TC20 après dilution au centième.
Immunocapture des cellules
Pour chaque échantillon prévu, les cellules sont diluées à la concentration voulue dans 1 mL du tampon choisi (PBS, plasma de lapin 100%, 80% plasma de lapin et 20% PBS etc.). Ensuite, 10 µL des échantillons sont prélevés pour une vérification de la concentration en cellules obtenue par comptage en cellule de Malassez. Les billes magnétiques sont vortexées pendant 2 minutes avant que le volume choisi ne soit ajouté à chaque échantillon. Les solutions sont incubées sous rotation douce à 20oC pendant 2 heures (temps optimisé lors d’expériences préliminaires décrites au §2.3.1). 100 µL de chaque échantillon sont ensuite prélevés pour une observation au microscope de la labélisation des cellules et de l’état d’agrégation des billes. Cette vérification permet de repérer tout problème potentiel dû aux échantillons comme la stabilité des billes fonctionnalisées.
4.3.2 Montage expérimental
Le montage est représenté schématiquement par la Fig. 4.7 A.
Boitier - pile Filtres & amplification Contrôleur de pression Carte d’acquisition
CHAMBRE BAS-BRUIT
Réservoir
d’entrée Puce µ-métal Aimant permanent
A
B
Figure 4.7 – Montage expérimental. A) La biopuce et le porte échantillon sont entièrement fixés dans l’entre-fer de l’aimant permanent, maintenus dans une zone de champ constant et relativement homogène. Les capteurs sont alimentés par un courant continu (entre 1 et 2 mA) délivré par une batterie rechargeable. Le signal est filtré et amplifié dans une enceinte blindée magnétiquement avant d’être envoyé vers une carte d’acquisition. Le contrôleur de pression, branché sur secteur, est maintenu hors de l’enceinte blindée. B) Réglage des angles de positionnement du capteur afin de maximiser la sensibilité et minimiser le bruit perçu. Ce réglage est fait alors que le capteur est soumis à un champ alternatif créé par une bobine autour du capteur en s’aidant d’un oscilloscope.
Potentiomètre Réglage tension Pont de Wheatstone GMR Filtres passe haut
Amplificateur bas bruit INA 103 Gain 500
Filtres passe bas 4èmeordre
Sortie
A B
Figure 4.8 – A) Photographie du boîtier d’amplification et de filtrage quatre voies. B) Schéma d’une voie de ce boîtier. Les valeurs des composants doivent être adaptées à la résistance du capteur utilisé. Le pont de Wheatstone doit être équilibré et les filtres correspondre aux fréquences de coupures choisies.
Fluidique
Après l’essai de différents pousse-seringues, la solution la plus adaptée au système s’est révélée être un contrôleur de pression. En effet, le moteur des pousses-seringues engendre du bruit perçu par les capteurs. L’appareil MFCSTM-EZ : Microfluidic Flow Control System (Fluigent ) a été retenu. Il permet d’injecter lesR
échantillons de manière très régulière dans le canal microfluidique. Comme il peut être placé loin du laboratoire sur puce (quelques mètres) ni l’alimentation sur secteur, ni la bouteille de gaz sous pression, n’engendrent de bruit supplémentaire sur les signaux. La pression appliquée est choisie par l’utilisateur grâce à un programme informatique sur une plage de 20 à 320 mbar. L’appareil pousse le liquide dans la puce microfluidique par l’action du gaz sous pression.
Electronique
Les deux boîtiers électroniques utilisés ont été réalisés au laboratoire. Le premier boîtier contient une batte- rie rechargeable permettant de ne pas travailler sur secteur4. Le second boîtier5, alimenté par le premier, filtre et amplifie les signaux émis par le capteur avant de les envoyer vers la carte d’acquisition. La tension d’ali- mentation du capteur est réglée à l’aide d’un potentiomètre. Le capteur est intégré à un pont de Wheatstone pré-équilibré par une résistance de valeur à peu près équivalente à celle du capteur GMR. Les deux branches du pont sont filtrées par un filtre passe haut de premier ordre de fréquence de coupure 15 Hz, permettant de s’af- franchir de la composante continue que le pont, non parfaitement équilibré, laisse. Les composantes variables des signaux sont ensuite amplifiées 500 fois à bas bruit par un amplificateur opérationnel de type INA 103 (Burr Brown ). A la sortie de l’amplificateur opérationnel, le signal est filtré par un filtre passe bas d’ordre 4R
de fréquence de coupure 10 kHz qui a un gain de 20. La Fig. 4.8 présente une photographie et le schéma du boîtier contenant filtres et amplification.
4. Ce boîtier a été conçu par Claude Fermon et réalisé par Nathanaël Brocard. 5. Ce boîtier a été conçu par Claude Fermon et réalisé par Romain Lacoste.
4.3. DÉROULÉ D’UNE EXPÉRIENCE 65
Vérifications et passage des échantillons
Le capteur est monté sur son support puis la mesure de sensibilité est réalisée grâce à une bobine calibrée fixée sur le support de l’aimant. La bobine délivre un champ de 2.8 10-2mT au niveau du capteur lorsqu’elle est
alimentée par un courant de 101 mA. Un décalage de quelques millimètres est possible d’un capteur à l’autre, entrainant une incertitude de l’ordre de 0.2 10-2 mT sur cette valeur. Elle est alimentée en courant alternatif à la fréquence de 100 Hz. Le positionnement précis du capteur dans le champ homogène, pour compenser l’hystérésis du capteur sans trop réduire sa sensibilité, est permis par un montage mécanique de hauteur fixe (au niveau de la zone d’homogénéité) avec vis micrométriques réglant les trois angles du plateau. La puce est vissée sur ce support, lui-même vissé sur la structure de l’aimant permanent. Ainsi, les capteurs sont solidaires de l’aimant permanent et ne vibrent pas (ce qui créerait de forts parasites). Ce réglage s’opère alors que la bobine fonctionne, nous permettant de rechercher le point de sensibilité maximale. Cette sensibilité est alors évaluée en mesurant à l’oscilloscope l’amplitude du signal perçu par le capteur. L’incertitude sur cette valeur peut être calculée selon l’équation (4.1), et de la même façon, il est possible de déduire de l’équation (4.2) l’incertitude de la mesure du champ correspondant à un signal d’amplitude (en volts) donnée. Pour chaque mesure présentée dans le Chapitre 5, ces deux incertitudes ont été évaluées.
∆S = 100 HbobGV0 ∆Vbob+ Vbob∆Hbob Hbob + Vbob∆V0 V0 (4.1) ∆Hmesure = 100 S GV0 ∆Vmesure+ Vmesure∆S S + Vmesure∆V0 V0 (4.2) Où :
— G est le gain de la chaine d’acquisition — S est la sensibilité du capteur (%.mT-1) — ∆S est son incertitude de mesure (%.mT-1)
— V0est la tension appliquée aux bornes du capteur (V)
— ∆V0est son incertitude de mesure (V), dépendant de l’incertitude du voltmètre utilisé
— Hbobest l’amplitude du champ magnétique généré au niveau du capteur par la bobine (mT)
— ∆Hbobest son incertitude de mesure (mT), dépendant du gaussmètre utilisé et du positionnement précis
du capteur par rapport à la bobine
— Vbobest l’amplitude du signal généré par la bobine en bout de chaine d’acquisition (V)
— ∆Vbobest son incertitude de mesure (V), égale au niveau de bruit
— Hmesureest l’amplitude du champ magnétique mesuré par le capteur pour un signal donné (mT)
— ∆Hmesureest son incertitude de mesure (mT)
— Vmesureest l’amplitude d’un signal mesuré donné (V)
— ∆Vmesureest son incertitude de mesure (V), égale au niveau de bruit
Le courant dans la bobine est alors coupé, et le bruit perçu par le capteur est mesuré comme étant le signal pic à pic résiduel. Le réservoir fluidique est introduit dans l’entrée de la puce et de l’eau est passée. Durant ce passage préliminaire, le niveau de bruit enregistré par le capteur est surveillé, aucune variation ne doit être observée.
Les expériences sont ensuite effectuées dans un ordre aléatoire. Tous les échantillons passés font le même volume et, entre les passages de deux échantillons, un même volume d’eau déionisée rince la puce.
Acquisition des données
L’acquisition des données se fait grâce à une carte d’acquisition (Data Translation) interfacée par un pro- gramme réalisé en Pascal (sous Lazarus). Ce programme acquiert les données par paquets de 6000 sous forme de caractères puis les enregistre sur un fichier. Il est capable d’enregistrer les données à des fréquences dépas-
sant le MHz sur plusieurs voies. Dans ce projet, la fréquence d’acquisition a été fixée à 200 kHz et le nombre de voies n’a jamais dépassé 2. Les fichiers enregistrés contiennent une seule colonne. La première ligne contient la fréquence d’enregistrement, la seconde, le nombre de voies enregistrées et toutes les suivantes sont les points expérimentaux dans l’ordre d’enregistrement.