Optimisation structurale et formulation

La molécule de GW3965 ne présente que très peu de groupements qui puissent être fonctionnalisés chimiquement. Il est également important d’effectuer ces modifications sans affecter ses propriétés de liaisons avec le récepteur LXR. En observant la structure cristallographique du complexe GW3965/LXR disponible dans la PDB (PDB code : 3IPQ), nous avons constaté que la fonction acide carboxylique du GW3965 pointe vers la surface de la protéine et est exposée au solvant. En nous appuyant sur cette observation, nous avons formulé l’hypothèse qu’une modification de cette fonction acide carboxylique en fonction ester n’altèrerait pas de façon drastique la capacité de liaison du GW3965 modifié au niveau de sa cible.

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Des esters possédant des chaînes alkyles de différentes longueurs (groupement méthyle, chaîne hydrocarbonée de douze atomes de carbone (C12) ou seize atomes de carbone (C16)) ont été en envisagés comme modification du GW3965 afin de lui conférer plus de lipophilie et lui permettre d’être mieux retenu dans les micelles.

1.1- Synthèse des dérivés du GW3965

Les dérivés du GW3965 ont été obtenus selon la voie de synthèse précédemment décrite pour le GW3965. Cette voie présente l’avantage d’être modulaire puisque le même précurseur (composé I.11) sera utilisé afin d’obtenir les nouveaux dérivés du GW3965 par couplage avec les modules I.12, I.15 ou I.16 qui incorporent des groupements R de taille variable.

Les composés I.12, I.15 et I.16 ont été obtenus par estérification de l’acide 3-hydroxyphenylacétique avec les alcools correspondants (respectivement, méthanol, dodécanol et hexadécanol) présence d’acide sulfurique. Les esters obtenus sont ensuite engagés dans une réaction de Mitsunobu avec le précurseur I.11 en présence de DIAD et de PPh3. Ce couplage permet d’accéder de façon efficace aux composés attendus I.13, I.17 et I.18 après purification.

Figure 47 : Structure cristallographique du complexe GW3965/LXR et structure du GW3965 avec la zone de modification envisagée.

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Les dérivés I.13, I.17 et I.18 (respectivement GW-OMe, GW-OC12 et GW-OC16) ont ensuite fait l’objet de différents essais de formulation dans les micelles PDA-PEG.

1.2- Formulation dans les micelles PDA-PEG et caractérisations

Nous avons formulé les dérivés du GW en suivant le protocole établi pour le GW3965. Les différents dérivés du GW3965 ont été solubilisés dans du chloroforme (solution à 5 mg mL−1), puis 200 µL de cette solution ont été ajoutés à 1 mL de micelles polymérisées PDA-PEG à 10 mg mL−1

dans l’eau. La suspension est ensuite traitée aux ultrasons afin de favoriser le transfert de la molécule hydrophobe dans la micelle et créer parallèlement un échauffement permettant au chloroforme de s’évaporer (30 min, puissance en sortie 45 %). Les différentes suspensions ont ensuite été filtrées sur membranes 0,2 µm afin d’éliminer la fraction non-encapsulée des dérivés du GW3965.

Trois formulations ont donc été obtenues :

Les différents échantillons ont ensuite été caractérisés par DLS qui confirme la présence de structures nanométriques de taille compatible (12-20 nm) avec les micelles. La quantification du chargement des micelles avec le dérivé du GW3965 a été par la suite réalisée par dosage spectroscopique UV-visible à 272 nm. Ce dosage permet de quantifier de manière absolue la fraction de GW3965-modifié encapsulé grâce à une droite de calibration préalablement obtenue.

Schéma 16 : Voie de synthèse des dérivés du GW3965.

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Nous constatons rapidement que le dérivé GW-OMe n’est pas stable dans le cœur de la micelle. Ce phénomène est similaire à celui observé pour la formulation du GW3965. En effet, un trouble apparaît après un jour de stockage à température ambiante ce qui indique probablement une libération de la molécule active dans le milieu.

Les dérivés GW-OC12 et –OC16 ont pu être formulé efficacement (respectivement 0,8 et 0,9 mg mL−1). Par ailleurs, des tests de stabilité ont été réalisés après 1 semaine de stockage à température ambiante et les quantités de dérivés du GW3965 restent inchangées. Cette observation confirme que la modification moléculaire permet une stabilisation par effet hydrophobe plus importante et autorise le maintien de la molécule active dans le cœur de la micelle.

Ces formulations GW-OC12@PDA-PEG et GW-OC16@PDA-PEG ont par la suite été étudiées vis-à-vis de leur capacité à activer in vitro la transcription des gènes ABCA1 et ABCG1.

1.3- Études in vitro sur l’efficacité de la formulation

Avant d’effectuer les études de pharmacocinétique, nous avons vérifié que les dérivés du GW-OC12 et -OC16, ainsi que leur formulation en micelles possédaient un mode d’action comparable à celui du GW3965, c’est-à-dire capable d’activer l’expression des gènes ABCA1 et ABCG1. Pour cela, des études d’activité transcriptionnelle in vitro similaires à celles réalisées sur la formulation GW@PDA-PEG ont été effectuées sur les deux formulations identifiées comme étant les plus stables en milieu aqueux : GW-OC12@PDA-PEG et GW-OC16@PDA-PEG.

Des macrophages inflammatoires issus de souris traitées au thioglycolate ont été mis en culture en présence de : i) GW3965, ii) GW-OC12, iii) GW-OC16 et iv) de leurs formulations en micelles et l’effet des différents composés sur le niveau d’expression de ABCA1 et ABCG1 a été mesuré par dosage des ARN messagers correspondants ([GW] = 100 nM).

Les profils obtenus montrent que les composés GW-OC12 et GW-OC16 seuls, préalablement solubilisés dans le DMSO, sont capables d’activer l’expression des gènes ABCA1 et ABCG1 même

Figure 49 : Résultats de l’étude in vitro permettant de mesurer l’effet activateur des formulations sur ABCA1 et ABCG1.

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si l’effet est légèrement moins prononcé que le composé GW3965 de référence. Ces résultats positifs suggèrent soit i) que la modification structurale du GW3965 au niveau de l’acide carboxylique transformé en ester n’affecte pas les propriétés de liaisons du dérivé au niveau du récepteur LXR soit ii) que la fonction ester est instable dans nos conditions de test, ce qui aurait pour effet de libérer progressivement le GW3965 non modifié au cours du temps. Quoi qu’il en soit les composés modifiés sont actifs sur l’expression des gènes cibles.

Par ailleurs, les composés GW-OC12 et GW-OC16 encapsulés dans les micelles PDA-PEG conduisent également à une activation de ABCA1 et ABCG1. Même si l’amplitude de cette activation est plus modérée que celle observée pour les composés seuls (non formulés en micelles), GW-OC16 a notamment un effet quantifiable sur l’activation ABCA1 et plus encore sur ABCG1. Cette tendance à l’activation des gènes cibles in vitro est plutôt prometteuse pour la suite de notre étude. Cette différence de comportement entre les esters de GW-OC12/OC16 dans le DMSO et les formulations micellaires (des mêmes composés), pourrait avoir pour origine la stabilité de colloïdale de GW-OC12@PDA-PEG et GW-OC16@PDA-PEG. En effet, les esters lipophiles restent préférentiellement encapsulés dans le cœur les micelles, les rendant peu disponibles pour des interactions avec leur cible. Afin de contourner cette limitation, des temps d’incubation plus longs (supérieurs à 24 h) pourraient permettre d’augmenter la proportion de molécules libérées dans le milieu.