Formulation du GW3965

5.1- Encapsulation du GW3965

La formulation du GW3965 consiste à utiliser les micelles polymérisées préalablement obtenues (PDA-PEG) pour encapsuler la molécule de GW3965 et l’emmener en solution aqueuse.

Le protocole standard d’encapsulation de molécules de nature hydrophobe dans les micelles PDA-PEG consiste à préparer une suspension aqueuse de micelles à laquelle est ajoutée une solution de la molécule à encapsuler dissoute dans un solvant organique (par ex. chloroforme). Le mélange est ensuite traité aux ultrasons afin de favoriser le transfert du composé dans le compartiment central hydrophobe de la micelle. Les ultrasons vont également créer un échauffement modéré, permettant au solvant de s’évaporer de façon concomitante à l’encapsulation. Ainsi, 200 µL d’une solution à 5 mg mL−1 de GW3965 dans du chloroforme sont mélangés à 1 mL d’une suspension de micelles polymérisées à 10 mg mL−1 pour être soniqués (30 min, puissance de sortie 45 %). La suspension est ensuite filtrée sur membrane de porosité 0,22 µm afin d’éliminer la fraction GW3965 non encapsulée. La quantité de principe actif encapsulé a été mesurée par un dosage par HPLC-MS (pic UV à 280 nm). Cette quantification permet

Schéma 12 : Voie de synthèse du GW3965.

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également de confirmer l’intégrité de la molécule de GW3965 après encapsulation dans les micelles.

Le protocole établi permet d’atteindre une concentration en GW3965 de 0,86 mg mL−1 dans 10 mg mL−1 de micelles soit un taux de chargement massique (CM) de 8 % et une efficacité d’encapsulation (EE) de 86 % déterminés à partir des formules suivantes :

CM = 100 ∗ ^{mprincipe actif}

m_{principe actif}+ m_vecteur ^{EE = 100 ∗}

m_GWfinal

m_{GW initial}

Ce même protocole a été suivi pour l’encapsulation de GW3965 sous sa forme chlorhydrate (GW3965∙HCl, composé commercial). La présence du sel ne semble pas influer sur l’efficacité d’encapsulation du GW3965 dans les micelles. Le taux d’encapsulation mesuré à 8% est comparable à ce que nous pouvons trouver dans la littérature. Ces résultats peuvent être comparés avec les résultats obtenus par plusieurs équipes sur des nanoparticules de copolymères, encapsulant du GW3965 où des valeurs de 60 et 80 % d’EE ont pu être atteintes.76,77 Compte tenu de ces résultats plutôt encourageants, des études plus approfondies (caractérisations de la nanoparticule et cinétique de libération) ont donc été réalisées.

76Zhang, X.-Q.; Even-Or, O.; Xu, X.; van Rosmalen, M.; Lim, L.; Gadde, S.; Farokhzad, O. C.; Fisher, E. A. Advanced

Healthcare Materials 2015, 4, 228-236.

77 Smith, T.K.T.; Kahiel, Z.; LeBlond, N.D.; Ghorbani, P.; Farah, E.; Al-Awosi, R.; Cote, M.; Gadde, S.; Fullerton, M.D. Molecules 2019, 24, 3751.

Figure 37 : Formulation du GW3965 dans des micelles PDA-PEG.

Figure 36 : Gamme d’étalonnage obtenue par HPLC-MS et profil HPLC-MS (280 nm) associé à la molécule de GW3965.

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5.2- Caractérisations de la formulation

Afin de justifier l’utilisation de cette formulation pour de futures études in vivo, un certain nombre de caractérisations ont été nécessaires notamment en ce qui concerne les aspects de taille et de stabilité de la formulation.

5.2.1- Détermination de la taille des particules

Une analyse par DLS a permis de déterminer le rayon hydrodynamique des micelles PDA-PEG encapsulant le GW3965. La taille des micelles encapsulant le GW3965 a été comparée à la taille des micelles vides. Aucune différence entre les deux formulations n’a été observée, nous mesurons un diamètre hydrodynamique moyen de 12 nm pour les deux échantillons.

5.2.2- Cinétique de libération du GW3965

Une étude sur la stabilité de la formulation a été réalisée afin d’évaluer la cinétique de libération de la molécule active. Pour qu’une molécule active soit libérée d’une micelle, il faut que la micelle se dissocie ou que la molécule active migre du cœur vers la périphérie de la micelle, pour finalement se retrouver dans le milieu environnant.

Les micelles PDA-PEG, ne sont que peu dissociables du fait de la polymérisation de leur cœur. Ainsi, la diffusion est probablement le mécanisme mis en jeu pour la libération de la molécule active. Afin d’étudier cette diffusion, une méthode consiste à dialyser la formulation contre un large volume d’eau. La membrane de dialyse utilisée présente une porosité qui ne laisse passer que les molécules dont le poids moléculaire est inférieur à la taille des pores (3,5 kDa), sans laisser diffuser les micelles qui restent « piégées » dans le compartiment de dialyse. Ainsi, si une fuite du principe actif a lieu, celui-ci sera libéré dans le milieu aqueux.

2 mL d’une suspension colloïde de micelles à 10 mg mL−1 contenant 0,86 mg mL−1 de GW3965 a été placée dans un boudin et dialysée contre 2 L d’eau ultra pure. La concentration résiduelle en GW3965 a été mesurée en fonction du temps dans le sac de dialyse. Nous observons que le profil de libération du GW3965 est relativement rapide avec environ 50 % de molécule libérée après

Figure 38 : Principe de la mesure de la cinétique de libération du GW3965 des micelles PDA-PEG par dialyse.

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seulement 2 h d’incubation. Au-delà de 5 h de dialyse, un palier est observé avec un peu plus de 60 % de GW3965 libéré.

Les micelles PDA-PEG sont donc capables non seulement de prendre en charge le GW3965 mais également de le libérer dans le milieu environnant. En revanche, compte tenu de la cinétique rapide de libération du GW3965 du cœur de la micelle, le stockage des suspensions doit être optimisé pour pouvoir faciliter l’utilisation de nos vecteurs nanométriques chargés en principes actifs.

5.2.3- Stabilité au stockage

Un colloïde de micelles PDA-PEG à 10 mg mL−1 encapsulant 0,86 mg mL−1 de GW3965 a donc été séparé en trois lots. Chaque lot a été testé pour une condition de stockage différente :

- échantillon 1 : liquide, stocké à température ambiante - échantillon 2 : liquide, stocké à 4 °C

- échantillon 3 : lyophilisat, stocké à température ambiante

La première observation est que les suspensions conservées à température ambiante et à 4 °C (échantillons 1 et 2) se troublent rapidement en 24 h, ce qui suggère une libération du principe actif dans le milieu. Les deux échantillons sont filtrés sur membrane 0,22 µm afin d’éliminer le GW3965 qui aurait pu diffuser hors des micelles et précipiter dans l’eau. La concentration résiduelle de GW3965 dans les micelles est ensuite déterminée par HPLC-MS et comparée à la quantité initialement encapsulée de GW3965. Le dosage des échantillons 1 et 2 montre une fuite du principe actif des micelles qui ne contiennent plus que 0,3 mg mL−1 de GW3965/10 mg mL-1 de micelle après 24 h. Cette valeur est à comparer au chargement initial de 0.86 mg mL−1, mesuré à t0, indiquant une perte de 65 %.

Le stockage en solution des micelles chargées n’est donc pas approprié. Par contre, une conservation sous forme lyophilisée permet de préserver le taux de chargement en GW3965. En effet, lorsque l’échantillon lyophilisé est repris dans le même volume d’eau qu’initialement après plusieurs jours de stockage à sec (2 semaines), nous mesurons un taux de chargement en GW3965 comparable au taux de chargement initial (0.86 mg mL-1) L’intégrité de la micelle a, par ailleurs, été validée par analyse DLS (12 nm). C’est sous cette forme lyophilisée que les micelles chargées

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en principe actif seront transmises à nos collaborateurs biologistes en vue d’évaluer la capacité du GW3965 formulé sous forme de micelles à augmenter l’expression de ABCA1.

5.2.4- Efficacité in vitro

L’efficacité in vitro de la formulation a été évaluée par un test d’activité transcriptionnelle, en collaboration avec l’équipe du Dr Philippe Lesnik (UMRS 1166). Une suspension de micelles encapsulant le GW3965 (8 % en masse) a été préparée puis évaluée vis-à-vis de sa capacité à activer l’expression de ABCA1 et ABCG1 in vitro.

À partir de souris LDLr, (voir paragraphe III.2 pour plus de détails sur le modèle), il est possible d’obtenir des macrophages inflammatoires. Pour cela, du thioglycolate est injecté dans la cavité péritonéale des souris et après trois jours d’inflammation, les macrophages sont collectés et mis en culture. Les macrophages sont alors incubés pendant 24 h avec soit du GW3956 solubilisé dans 1 % de DMSO (contrôle positif), soit des micelles chargées en GW3965 à 8 % massique. Dans ces deux cas de figure, la concentration finale de GW3956 dans le milieu est de 100 nM. Les formulations ont été évaluées vis-à-vis de la capacité du GW3956 (natif et formulé) à augmenter le niveau d’expression de ABCA1 et ABCG1 (dosage de l’ARN messager codant pour ABCA1 et ABCG1).

La première observation est que le GW3965 solubilisé dans 1 % de DMSO ([GW3965] finale = 100 nM) induit un effet activateur (× 6) de l’expression de ABCA1 dans les macrophages. Cet effet est également observé pour la formulation à 8 % du GW3965 dans les micelles PDA-PEG. Une activation de l’expression de ABCG1 un peu plus modérée est observée pour le composé seul ou formulé dans les micelles. Ces résultats montrent que la formulation n’impacte pas de façon négative l’effet activateur du GW3965 puisqu’une formulation à 8 % permet même de reproduire l’effet du médicament seul. Néanmoins, en prenant en compte nos observations antérieures pour les micelles chargées à 8 % concernant le profil de libération du GW3965 in vitro, nous ne pouvons exclure qu’une quantité importante de GW3965 soit libérée spontanément ce qui expliquerait ces résultats (Figure 41).

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En parallèle à ces expériences in vitro, des études in vivo nous ont permis d’obtenir des profils de pharmacocinétique et de biodistribution sur les micelles seules mais aussi sur la formulation du GW3965. C’est ce que nous allons détailler dans la partie suivante de ce chapitre.