Optimisation du rapport signal-sur-bruit

Pour évaluer la contribution des interactions non-spécifiques sur les trois types de monocouches fabriquées (SAM100% COOH, SAM50% COOH et SAM25% COOH), le peptide

spécifique P et le peptide irrelevant T sont immobilisés à la même densité massique sur deux canaux du transducteur SPR. La reconnaissance des anticorps anti-P est ensuite mesurée simultanément sur les deux canaux fonctionnalisés pour cinq concentrations d’anticorps (de 0.125 µg/ml à 2 µg/ml). Le rapport signal-sur-bruit est défini par le rapport entre le niveau de liaison lors de l’interaction spécifique anti-P/P et le niveau de liaison lors de l’interaction non- spécifique anti-P/T. Les résultats obtenus pour les trois compositions de SAM sont présentés sur la figure 4.5a). D’après ce graphique, les plus fortes valeurs de rapport signal-sur-bruit sont obtenues avec la SAM25% COOH suivie de la SAM50% COOH quelque soit la concentration en

anticorps. Ces courbes montrent aussi que le rapport augmente légèrement avec la concentration en anticorps, ce qui laisse supposer que les interactions non-spécifiques varient peu avec l’augmentation de la concentration alors que les interactions spécifiques suivent un effet dose. Ainsi, même si les interactions spécifiques sont au moins cinq fois supérieures aux interactions non-spécifiques (sauf dans les plus faibles concentrations où il est de quatre environ), il est nécessaire d’améliorer encore ce rapport signal-sur-bruit en prévision du passage de sérum (milieux complexes très chargés en protéines).

Figure 4.5 : Influence de la composition de la SAM sur le rapport signal-sur-bruit pour (a) des monocouches sans chaînes polyéthylène glycol (PEG) et (b) des monocouches avec des chaînes PEG. Le rapport signal-sur-bruit correspond au rapport entre le niveau obtenu pour

l’interaction spécifique anti-P/P et l’interaction non-spécifique anti-P/T.

De manière générale, à l’origine des interactions non-spécifiques, il y a entre autres des liaisons de type hydrophobe-hydrophobe entre les protéines et la SAM. L’introduction de chaînes polyéthylène glycol (PEG) hydrophiles dans la couche limite les effets d’adsorption passive des protéines [8,9]. C’est pourquoi, lors de la réalisation de la monocouche autoassemblée, nous avons remplacé les molécules à chaînes aliphatiques MUA et MUD par des dérivés contenant six chaînes PEG supplémentaires, donnant des molécules SH-(CH2)11-

(O-CH2-CH2)6-O-CH2-COOH et SH-(CH2)11-(O-CH2-CH2)6-O-CH2-OH, respectivement. Les

monocouches formées par ces molécules permettent d’immobiliser les peptides à des niveaux comparables à ceux obtenus sur les SAM sans PEG (résultats non montrés). L’étude des rapports signal-sur-bruit a donc pu être menée et les niveaux comparés à ceux obtenus sans les chaînes PEG. Les résultats, présentés sur la figure 4.5b), montrent tout d’abord que le rapport signal-sur-bruit est plus élevé lors de l’introduction des chaînes PEG, comparativement au rapport obtenu sur les monocouches initiales. Aussi, une nette augmentation du rapport pour les SAM PEG 25% COOH et 50% COOH peut être observée pour une concentration en anticorps anti-P supérieure ou égale à 1 µg/ml.

L’ensemble des résultats obtenus, que ce soit au niveau de l’interaction spécifique anti-P/P qu’au niveau des interactions non-spécifiques, montre que la SAM comprenant des chaînes PEG et composée à 25% de fonctions carboxyles et 75% de fonctions hydroxyles donne les meilleures performances. Nous avons donc choisi d’utiliser cette monocouche pour les expériences de détection des anticorps dans un sérum humain.

IV.2.1.4 Vers une application diagnostic : reconnaissance d’anticorps dans un sérum humain

Avant d’étudier la concentration minimum détectable d’anticorps anti-peptide dans un sérum humain, il est intéressant de s’attarder sur le comportement de la monocouche fonctionnalisée en termes d’interactions non-spécifiques lors de l’injection de sérum humain. Pour cette étude, un mélange de trois sérums humains sains (provenant de l’Etablissement

Français du Sang) dilué 100 fois a été utilisé sur une monocouche fonctionnalisée avec les peptides P comprenant des chaînes PEG et composée de 25% de groupes COOH et 75% de groupes OH. Comme ces travaux concernent une étude comportementale, la QCM a été utilisée, non seulement pour quantifier les interactions non-spécifiques induites par le sérum, mais aussi approfondir les propriétés viscoélastiques de la couche dans cette configuration. En effet, des détergents sont souvent utilisés pour réduire les adsorptions non-spécifiques induites par les protéines du sérum. Mais la présence de détergent peut changer les propriétés d’une protéine en affectant sa structure et ainsi affecter les interactions à étudier. Aussi, les informations données par la dissipation permettent d’étudier l’effet sur la couche de détergents mélangés à un sérum. Dans notre cas, plusieurs surfactants ont été testés et les meilleurs résultats ont été obtenus avec le N-lauroylsarcosine (communément appelé sarkosyl). Comme le montre la figure 4.6a), la seule injection de sérum dilué au 1 :100 donne une nette diminution de la fréquence de résonance, indiquant un fort niveau d’adsorption non- spécifique des protéines du sérum. Par contre, l’addition de sarkosyl à des taux de 0.25%, 0.5% et 1% au sérum réduit les interactions non-spécifiques, et l’utilisation de 1% de sarkosyl supprime presque totalement toute adsorption. Mais l’utilisation d’une quantité de détergent élevée peut détériorer la couche biologique sensible. C’est pourquoi, nous avons représenté les variations de dissipation en fonction des variations de fréquence, ce tracé étant caractéristique de l’évolution des propriétés viscoélastiques de la couche. Comme présenté sur la figure 4.6b), une pente pour chaque taux de sarkosyl a été calculée, dont la valeur donne des informations sur la flexibilité de la couche. Les différentes pentes obtenues en fonction de la quantité de sarkosyl montrent que les adsorptions non-spécifiques des protéines du sérum en présence de détergent induisent des changements de rigidité de la SAM. Ainsi, en comparant la pente lors de l’injection de sérum sans sarkosyl à celles calculées pour les différents taux de détergent, nous avons trouvé que les propriétés viscoélastiques de la SAM PEG fonctionnalisée étaient similaires sans sarkosyl et avec 0.5% de sarkosyl. De plus, la variation de fréquence de résonance est réduite d’un facteur trois lors de l’addition de 0.5% de sarkosyl (figure 4.6a)), révélant une nette diminution des interactions non-spécifiques. Ces résultats ont déterminé notre choix d’ajouter 0.5% de sarkosyl dans la solution de sérum contenant les anticorps pour les expériences de détection d’anticorps par SPR dans les sérums.

Figure 4.6 : Influence de la quantité de sarkosyl mélangée à un sérum humain (dilué 100 fois) pour une SAM PEG 25% COOH/ 75% OH sur (a) le niveau d’interactions non-spécifiques et

Comme il a été vu, pour minimiser l’influence de variabilité de composition du sérum, un mélange de trois sérums humains sains a été utilisé. Pour déterminer une limite de détection des anticorps anti-P, différentes quantités de ces derniers ont été dilués dans le mélange de sérums (à une dilution 1/100) en présence de 0.5% de sarkosyl. Ainsi, comme le montre la figure 4.7, une concentration de 0.2 nM en anticorps a pu être détectée de manière reproductible par SPR sur la monocouche PEG composée à 25% de groupes carboxyles et 75% de groupes hydroxyles. La courbe de calibration obtenue est linéaire dans la gamme 0.2- 13.3 nM, confirmant la haute résolution de la détection. Les conditions d’optimisation préalablement établies font que le niveau d’interactions non-spécifiques sur le peptide témoin est négligeable. Comparativement, la limite de détection obtenue est dix fois plus faible que celle obtenue dans des études par SPR pour la détection d’anticorps anti-GAD [2, 10]. De plus, nous avons montré la faisabilité dans un environnement sérique de la détection d’anticorps polyclonaux. La limite de détection obtenue s’insère dans une réalité diagnostic puisqu’elle s’intègre dans la gamme de détection des autoanticorps anti-IA2, mesurée par fluorométrie sur des sérums de patients atteints par le diabète de type 1 [11], même si la limite obtenue se trouve dans les valeurs hautes de concentrations effectives chez les patients. Néanmoins, l’ensemble des résultats montre une démarche possible pour l’optimisation de la couche biologique sensible pour augmenter la spécificité d’un biocapteur qui est capitale pour le développement de ce domaine. Mais, malgré la généricité du protocole, le nombre d’étapes nécessaires à l’immobilisation des biorécepteurs ne serait pas encore favorable au transfert du protocole sur les micromembranes. En effet, la première étape de validation des structures fabriquées en tant que biocapteur passe par un protocole d’immobilisation simple, pour une bioreconnaissance aisée. Aussi, comme il a été vu, le rendement de structures effectives nous a incité à utiliser des membranes avec le dioxyde de silicium de passivation comme couche d’accroche qui, couplée à une monocouche de poly-l-lysine PEG fonctionnalisée, représente un cas simple pour la mise en évidence de la capacité des microstructures pour la transduction d’une bioreconnaissance d’affinité.

Figure 4.7 : Niveau de reconnaissance spécifique d’anticorps anti-P injectés dans un sérum humain.

IV.2.2 Micromembranes piézoélectriques pour la détection sans