Obtention de cristaux

Ø ^{Conditions de cristallisation}

Le premier criblage utilisé pour AtFuT1 a été le sparse matrix « structure screen 2 » commercialisé par « molecular dimensions ». Il s’agit d’un test standard, qui permet d’identifier des conditions initiales à partir d’une grande variété de précipitants, pH et tampons. Ce premier criblage a été effectué à 21°C avec une protéine concentrée à 10 mg/ml dans un tampon HEPES 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. Une quinzaine de conditions (sur 50) ont été identifiées comme prometteuses : soit du fait de la présence de micro-cristaux, soit de séparations de phases. Parmi les quinze conditions identifiées, six contenaient du PEG (entre 100 et 20000 Da). Plusieurs « grid screen » ont donc été effectués autour de ces conditions en utilisant du PEG de différentes tailles. Le PEG 8 K a permis d’obtenir régulièrement des petits cristaux instables ou des séparations de phases. Globalement, des cristaux ont pu être formés fréquemment avec l’utilisation de PEG 8 K dans un intervalle de pH de 7 à 8 en tampon HEPES, avec 7 ou 10 mg de protéine par ml. À 7 mg/ml, avec 250 à 500 mM de NaCl, la protéine a tendance à cristalliser à des concentrations en PEG 8 K de 14 – 16 % (m/v) à 4°C. Dans les mêmes conditions à 21°C, les concentrations de PEG auxquelles les cristaux apparaissent sont de 18 – 22 %. D’autres conditions permettant d’obtenir des cristaux ont été trouvées avec le kit commercial « Clear strategy Screen I MD1-14 ». La protéine est utilisée à 7 mg/ml et la plaque incubée à 21°C. Cinq conditions permettant d’obtenir des cristaux ont été identifiées :

Tableau VI.1 : conditions induisant la formation de cristaux avec le kit « clear strategy Screen I MD-1-14 »

Ce kit est fourni par Molecular Dimension. Le tampon HEPES-NaOH pH 7,5 est employé dans toutes les

conditions.

N°= condition Temps d’apparition

1 0,3 M Na acétate ; 25 % PEG 2 K MME 5-8 jours

4 0,2 M KBr ; 25 % PEG2 K MME > 30 jours

6 0,8 M Na formate ; 25 % PEG 2 K MME > 30 jours

7 0,3 M Na acétate 15 % PEG 4K 5-8 jours

Les conditions 1 et 7 étant très proches, elles ont été sélectionnées pour être affinées par un « grid screen ». Ces grid screens ont été effectués autour de la condition n°=7 : de 10 à 20 % de PEG 4 K entre les pH de 7 à 8 (par incréments de 1 puis 0,3) et entre 0 et 500 mM de Na-acétate (par incréments de 50 mM).

Au final, deux gammes de conditions permettent d’obtenir des cristaux de manière reproductible (Figure VI.1). La protéine doit pour cela être utilisée dans les quelques jours après sa purification.

Figure VI.1 : Schémas des conditions permettant d’obtenir des cristaux d’AtFuT1.

Plaques de 48 puits (Hampton), 0,1 ml par réservoir. Les gouttes sont réalisées avec 1 μl de solution de réservoir et 1 μl de protéine à 7 mg ml, puis les plaques maintenues à 21°C. Le type de PEG (4 ou 8 K) et sa concentration ainsi que la nature du sel utilisé sont les paramètres les plus importants. Les concentrations de sels et le pH influencent moins le temps de formation des cristaux ou leur probabilité d’apparition.

Avec les deux gammes sélectionnées, les cristaux apparaissent en premier aux concentrations de PEG les plus importantes (6 – 7 jours), et plus tard aux concentrations faibles (10-15 jours). Ce sont à ces concentrations qu’ils deviennent aussi les plus gros. Les conditions précises dans lesquelles apparaissent les cristaux au sein de ces gammes

pH:$ 6,8 7,2 7,5 7,8 6,8 7,2 7,5 7,8 18% A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 20% B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 22% C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 18% D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 20% E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 22% F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 pH$: 6,8 7,2 7,5 7,8 6,8 7,2 7,5 7,8 0$mM$NaCl 250$mM$NaCl 500$mM$NaCl 750$mM$NaCl PEG$8$K pH:$ 7 7,5 8 8,2 7 7,5 8 8,2 20% A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 22% B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 24% C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 20% D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 22% E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 24% F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 pH$: 7 7,5 8 8,2 7 7,5 8 8,2 PEG$4$K 400$mM$NaCH3COO 500$mM$NaCH3COO 200$mM$NaCH3COO 300$mM$NaCH3COO

sont légèrement variables, d’un lot de protéines à l’autre. C’est la raison pour laquelle il n’a pas été possible d’affiner davantage le criblage.

Ø ^{Caractéristiques des cristaux obtenus}

Les longueurs, épaisseurs et tailles des cristaux obtenus varient fortement entre les conditions et au sein d’une même goutte (Figure VI.2).

Figure VI.2 : Allure des cristaux d’AtFuT1 fréquemment obtenus.

Condition gauche : 20 % PEG 8K, 500 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,5 ; Conditions droite : 18 % PEG 8K, 500 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,8.

Cette caractéristique est probablement due à l’hétérogénéité intrinsèque des molécules de protéine et entre les différents lots de protéines purifiées. Surtout, ils poussent fréquemment sur une membrane située à l’interface des deux phases formées dans la goutte rendant difficile leur prélèvement (Figure VI.3).

Figure VI.3 : Cristaux d’AtFuT1 fixé à une membrane

A gauche, attachés à la membrane, visible sur la photo (20 % PEG 4K, 500 mM NaCH3COO, pH 8) ; à droite : en train d’être prélevés (« pêchés ») manuellement pour être transférés dans une solution de cryoconservation (22 % PEG 4K, 500 mM NaCH3COO, pH 7,5).

Les jeux de données collectés sur les premiers cristaux passés au synchrotron atteignent des résolutions de 2,5 – 3 Å. Ces mesures de diffractions ont permis d’identifier deux dimensions de mailles présentant des caractéristiques différentes (Tableau VI.2). La maille 1 est constituée de deux monomères d’AtFuT1 et la maille 2 de quatre monomères.

Tableau VI.2 : les dimensions des deux mailles cristallines régulièrement mesurées :

Groupe d’espace a (Å) b (Å) c (Å) β (°) Nombre de monomères Maille 1 P21 88 83 150 96 4 Maille 2 P21 81 78 87 115 2 Ø Choix du cryoprotectant

Les PEGs 4K et 8K ne sont pas cryoprotectants aux concentrations utilisées pour la formation des cristaux d’AtFuT1. Plusieurs solutions ont donc été testées pour préserver les cristaux. La méthode utilisée consiste à les prélever de leur solution de cristallisation, pour les tremper dans le cryoprotectant. Dans un premier temps, une observation au microscope permet d’observer une éventuelle dégradation du cristal (éclatement, apparition de fissures,...) puis des mesures de diffraction confirment la qualité des données de diffractions recueillies.

La condition retenue consiste à ajouter 15 % d’éthylène glycol à la solution de cristallisation. Puisque les concentrations de sels et le pH semblent avoir peu d’effet sur les cristaux, seules deux solution cryoprotectantes sont réalisées, choisies en fonction de la solution mère des cristaux :

- Solution cryo ♯ 1 : 100 mM HEPES pH 7,5 ; 18 % de PEG 8 K, 500 mM NaCl ; 15% EG)

- Solution cryo ♯ 2 : 100 mM HEPES pH 7,5 ; 20% de PEG 4 K ; 500 mM Na acétate ; 15% EG)

Cette méthode de conservation des cristaux améliore en moyenne la qualité des données de diffraction et les résolutions obtenues : à 2 – 2,5 Å pour environ 1/5 des cristaux pêchés.