Clonage et tests de production de protéines en bactéries

protéines en bactéries

Deux séquences : AtFuT1Δ68 et AtFuT1Δ93 ont été amplifiées par PCR à partir du plasmide pVT-Bac-His_AtFuT1Δ68 et clonées dans différents plasmides bactériens. La majorité des plasmides utilisés induisent l’expression de la protéine d’intérêt suite à l’ajout d’IPTG dans le milieu de culture. Les paragraphes suivants présentent brièvement le principe du système ainsi que la méthode employée.

Ø ^{Principe de l’induction par IPTG avec les plasmides pET}

Les plasmides pET s’utilisent en combinaison avec une souche de bactéries (DE3) contenant le gène d’une polymérase virale : l’ARN polymérase T7, codée sur le chromosome (Figure VIII.1). La transcription de cette ARN polymérase est sous le contrôle du promoteur et de l’opérateur lactose.

Figure VIII.1 : Illustration du système d'induction à l'IPTG utilisé avec les souches E. coli DE3 et les plasmides pET.

Les souches utilisées (DE3) possèdent le gène codant pour l’ARN polymérase T7, sous le contrôle de l’opérateur lacO de l’opéron lactose (à gauche sur la figure). La présence de l’IPTG lève la répression induite

sur les opérateurs lactose : sur l’ADN génomique et plasmidique. La polymérase T7 est alors exprimée. Celle-ci se fixe sur son promoteur T7 présent sur le plasmide et transcrit les gènes d’intérêts situés en aval.

Cet opérateur, à l’état stable, est lié à un répresseur de transcription : la protéine LacI codée à la fois sur le génome de la bactérie et sur le plasmide. LacI se lie au sillon majeur de l’opérateur lactose. Cette liaison augmente l’affinité spécifique de l’ARN pour son promoteur, à tel point qu’elle ne peut plus s’en échapper pour entrer dans la phase d’élongation. La présence de lactose ou d’un analogue du lactose comme de l’IPTG change la conformation de LacI et supprime sa liaison avec l’opérateur. La transcription du gène en aval de l’opérateur Lac s’effectue alors correctement et l’ARN polymérase virale codée sur le génome bactérien est produite. Cette dernière reconnaît spécifiquement le promoteur viral T7 et transcrit très fortement les gènes placés sous son contrôle.

Ø ^{Clonages des inserts en plasmides bactériens}

• Méthode de clonage des inserts

Les séquences correspondant aux troncations AtFuT1Δ68 et AtFuT1Δ93 ont été amplifiées par PCR, à partir du plasmide pVT-Bac-His. Les produits PCR sont d’abord déposés et migrés en gel d’agarose pour contrôler leur taille et les purifier du mélange de réaction. Les bandes qui correspondent aux tailles d’intérêts sont alors découpées et solubilisées. Enfin, les amplicons sont repris en eau, pour pouvoir ensuite faire agir les enzymes de digestion avec le tampon approprié. Le plasmide accepteur est produit en bactérie puis extrait par « minipréparation » ou « miniprep ». Ce procédé consiste à lyser les bactéries et à séparer l’ADN plasmidique de d’ADN génomique et des protéines. Les plasmides obtenus sont linéarisés par les enzymes de restriction d’intérêt et purifiés par une migration en gel d’agarose. La ligation s’effectue ensuite avec une concentration molaire d’inserts environ trois fois plus élevées que celle de plasmides. Quelques microlitres de cette réaction de ligation sont alors utilisés pour transformer des bactéries TOP10. Ces bactéries transformées sont étalées sur un milieu LB (lysogeny broth) gélosé, contenant l’antibiotique dont la résistance est conférée à la bactérie par le plasmide. Certains clones sont sélectionnés pour vérifier la présence de l’insert par PCR puis par digestion du plasmide, préalablement à un envoie au séquençage. Ensuite, ces préparations de plasmides sont utilisées pour transformer les souches utilisées pour l’expression de protéines.

• Amplification de séquences par polymérisation en chaine (PCR)

Les séquences d’intérêt ont été amplifiées à partir de l’ADNc (complémentaire) d’AtFuT1 issu de la base de donnée génétique TAIR (The Arabidopsis Information Resource) et cloné dans le plasmide pENTR. Le mélange réactionnel : oligonucléotides (10 μM chacun), polymérase (Hot start, Qiagen - 2,5 unité pour 50 μL final) ADN

plasmidique (50 ng/μL) ont été soumis aux variations de températures du thermocycleur Master Cycle gradient, (Eppendorf). Le programme employé est celui recommandé par le fournisseur, avec une température d’hybridation de 56°C pour les 5 premiers cycles et de 60°C pour les 24 suivants. L’élongation est réalisée à 72°C pendant une minute et quarante secondes. Une étape d’extension est ajouté à la fin des cycles : 10 min à 72°C. La nature des amorces oligonucléotidiques est détaillée ci-dessous, pour chaque insert dans chaque vecteur.

• Clonage d’AtFuT1 dans le plasmide pET-TEV

Le vecteur pET-TEV est issu du plasmide commercial pET28 (Novagen). Le site de clivage de la thrombine et le tag T7 ont été supprimés. Le site de clivage de la protéase TEV a été ajouté, pour retirer l’étiquette His-tag située en partie N-terminale de l’insert. Une deuxième étiquette his-tag se trouve en aval du site de clonage, mais les troncations d’AtFuT1 ont été insérées avec leurs codons stop.

Les couples d’amorces utilisées pour amplifier les séquences tronquées d’AtFuT1 par PCR sont : NdeI-AtFuT1-68 (sens) ATATATCCATATGTCAAATCGGATTATGGGTTTCG et EcoRI-AtFuT1 (antisens) GGGGACTTAAGCTAGTATGAGAATTCCGG pour AtFuT1Δ68 ; et

NdeI-AtFuT1-93 (sens) ATATATCCATATGTCTGATAAGCTTCTCGGAGGGC et EcoRI-AtFuT1 (antisens) pour EcoRI-AtFuT1Δ93. Ces amorces comportent les sites de clonages EcoRI et de NdeI (en jaune et cyan respectivement) utilisées pour l’insertion dans le plasmide.

• Clonage dans les plasmides pET-32-TEV

Ces deux plasmides ne comportent pas le site de clonage NdeI utilisé avec pET-TEV. Les amorces commandées pour inclure NcoI dans le cadre de lecture sont (sens 5’ -> 3’) : NcoI-FuT1-68 TATCCCATGGCATCAAATCGGATTATGGGTTTCG et NcoI-FuT1-93 TATCCCATGGCATCTGATAAGCTTCTCGGAG. Le site NcoI est surligné en cyan et les deux nucléotides ajoutés pour rester dans le cadre de lecture en vert.

• Clonage dans les plasmides pBADM-41+ et pMALp2-TEV

Les inserts AtFuT1Δ68 etAtFuT1Δ93 ont été extraits par digestion à partir du plasmide

pET-32-TEV par l’utilisation des enzymes NcoI et EcoRI, puis ligués dans les plasmides d’intérêts.

• Transformation des bactéries

L’ADN plasmidique contenant la construction d’intérêt est inséré dans des bactéries compétentes par un choc thermique : 1 ng de plasmide est mélangé à 50 µl de bactéries compétentes. Après 30 mn d’incubation dans la glace, le mélange est placé à 45 sec à 42°C. Après une seconde incubation de 2 min dans la glace, les cellules sont incubées dans 1 ml de milieu LB pendant 45 min à 37°C, sous agitation (200 tpm). Les cellules

sont ensuite étalées sur du milieu LB contenant l’antibiotique (1mM) nécessaire à la sélection.

• Test d’expression de protéine en bactérie

La production de la protéine est induite entre le début et le milieu de la phase exponentielle de croissance, estimée par une mesure de la densité optique du milieu. Cette induction est réalisée par l’ajout d’une molécule exogène : de l’IPTG ou de l’arabinose, selon le promoteur du plasmide. Une fois la phase d’induction terminée, les bactéries sont centrifugées à 8000xg, reprises en tampon (1/25 ième du volume de culture) et broyées dans un désintégrateur de cellules (CellD) à 1,9 Kbar. Le lysa bactérien est alors centrifugé à nouveau, plus rapidement (50 000xg). Cette deuxième centrifugation sépare les fragments de cellules et les agrégats de protéines mal repliées (dont les corps d’inclusions), des particules solubles qui restent en suspension.