IV. Caractérisation biochimique d’AtFuT1
IV.3. Caractérisation des deux formes purifiées
Lors de la filtration sur gel, la taille à laquelle AtFuT1 élue principalement correspond à un état en dimère. Cette observation est cohérente avec une étude menée par Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) sur cette enzyme (Y.-H. Chou et al., 2014). Cependant, cette dernière étude a également abouti à la conclusion que l’état de dimérisation serait dû à au moins un pont disulfure inter-chaîne, ce qui dans notre cas reste à établir. Jusqu’alors, les analyses de la protéine AtFuT1 en SDS-PAGE que nous avons effectuées étaient en conditions dénaturantes et réductrices, ce qui ne permet pas d’identifier la présence de ponts disulfures entre deux monomères.
Par ailleurs, deux bandes correspondant à la taille d’AtFuT1 monomérique sont observées en SDS-PAGE, avec une différence de taille d’environ 6 kDa. En filtration sur gel, la forme du pic d’élution n’est pas parfaitement gaussienne (cf figure III.10). Deux hypothèses peuvent expliquer ces observations : la co-purification d’une protéine chaperonne ou partenaire et/ou une différence de modification post-traductionnelle. Des expériences de migration en SDS-PAGE en conditions réductrices (R+) et non réductrices (R-), des mesures par spectrométrie de masse, des tests de déglycosylation et un séquençage N-terminal de chacune des bandes protéiques ont été réalisés sur AtFuT1 purifiée pour déterminer le type de liaisons qui associent les monomères, ainsi que la nature précise des deux bandes protéiques.
Ø Analyse SDS-PAGE
Afin de vérifier l’implication de ponts disulfures dans la dimérisation d’AtFuT1, nous avons analysé en SDS-PAGE des échantillons de protéine AtFuT1 purifiée en conditions réductrices (R+) et non réductrices (R-) (figure IV.8).
Figure IV.8 : Analyse d’AtFuT1 par SDS-PAGE en conditions réductrices (R+) et non réductrices (R-) AtFuT1 purifiée est dénaturée en conditions réductrices (R+) et non réductrices (R-). Dépôts de 7 μg de protéine par puits, préalablement traitée ou non avec 10 % de β mercapto-éthanol pendant 10 mn. Analyse de l’image par « Image Lab ».
En conditions non-réductrices (R-), AtFuT1 migre majoritairement sous la forme d’une bande diffuse avec une masse moléculaire estimée autour de 47-50 kDa. En conditions réductrices (R+), la protéine migre clairement sous la forme de 2 bandes séparées de masses moléculaires estimées à 53 et 59 kDa. Il semble donc que la protéine AtFuT1 existe sous forme d’un dimère ne présentant pas de ponts disulfures inter-chaînes. Ce résultat contredit les données biochimiques publiées par Chou et coll (2014). Il est cependant important de noter que les constructions des deux études sont différentes : protéine tronquée du domaine transmembranaire dans notre cas et protéine complète dans leur étude.
La différence de mobilité électrophorétique de la protéine AtFuT1 en conditions réductrices et non réductrices pourrait s’expliquer par l’existence de ponts disulfures intra-chaînes, préservés dans le cas de l’échantillon non réduit. En permettant à la protéine AtFuT1 de conserver une forme davantage globulaire, ces ponts disulfures augmenteraient la vitesse de migration de la protéine. Ces ponts disulfures intra-chaînes sont d’ailleurs prédits par l’analyse de la séquence primaire avec le logiciel DiANNA (voir figure II.2).
Ø Déterminations de masses par MALDI-TOF
De manière à pouvoir déterminer plus précisément la masse des espèces moléculaires purifiées, plusieurs échantillons ont été analysés par MALDI-TOF (figure IV.9).
M R- R+ 150 100 75 50 37 kDa
Figure IV.9 : Spectre MALDI-TOF d’échantillons d’AtFuT1.
À gauche : en sortie de purification par affinité, milieu Express-five (cf figure 3.6). A droite : en sortie de filtration sur gel, milieu Ex-cell 405.
L’analyse confirme la présence de deux espèces moléculaires de 58 kDa et 62 kDa correspondant, respectivement, aux bandes basse et haute observées en SDS-PAGE. Par ailleurs, l’analyse MALDI révèle de façon intéressante que la plus haute masse est supérieure de presque 3kDa (62,3 kDa) à celle attendue pour la construction exprimée (MM théorique 59,7 kDa). La protéine AtFuT1 possède deux sites potentiels de N-glycosylation dans la séquence exprimée. Il est plausible que l’écart entre la masse réelle et la masse attendue soit causée par l’occupation de ces sites par des N-glycannes. La bande de plus haute masse serait donc la protéine AtFuT1 potentiellement N-glycosylée. Par contre la présence d’une espèce moléculaire à 58 kDa reste inexpliquée, d’autant plus que sa masse est inférieure à la masse attendue de la protéine non glycosylée (59,7 kDa). Des tests de déglycosylation et un séquençage N-terminal ont donc été effectués pour comprendre la nature de ces deux espèces protéiques.
Ø Test de dé-glycosylation
Une glycosylation hétérogène peut induire des masses différentes pour une même protéine. Deux sites de glycosylation sont prédits sur la séquence primaire d’AtFuT1. Trois états de glycosylation sont possibles : aucun site, un site, ou deux sites occupés. L’expérience repose sur l’hypothèse (i) que des N-glycannes sont présents à la surface de la protéine, (ii) qu’ils peuvent être clivés par un endoglucanase et que (iii) la différence de masse induite est observable par migration sur SDS-PAGE, ou quantifiable par MALDI-TOF. La figure IV.10 illustre les types de N-glycannes retrouvés majoritairement sur les protéines produites en cellules d’insecte. Des tests de
dé-4000 m/z Ab o n d a n ce re la ti ve 8000 60000 100 80 60 40 20 m/z=57987 m/z=62382 75 50 37 kDa M Ech 75 50 37 5000 m/z Ab o n d a n ce re la ti ve 7000 60000 100 80 60 40 20 m/z=58048 m/z=62315 kDa M Ech
glycosylation ont été effectués avec la peptide N-glycosidase A (PNGase A, Sigma) qui possède la spécificité de cliver les N-glycannes présentant un fucose lié en α1,3 sur le résidu GlcNAc proximal.
Figure IV.10 : Quatre N-glycannes majoritaires des cellules High-Five
Représentation de quatre N-glycannes majoritairement retrouvés sur les protéines N-glycosylées sécrétées à
partir de cellules d’insectes High-five. D’après Ding 2003 et Dojima 2009.
La bande correspondant à la fétuine incubée en présence de la PNGase A semble migrer légèrement plus bas que celle sans endoglucanase (Figure IV.11). En revanche, aucun
effet n’a été observé sur AtFuT1.
Figure IV.11 : test de déglycosylation d’AtFuT1
Migration des échantillons en SDS-PAGE 12 % d’acrylamide. Les protéines AtFuT1 et fétuine ont été incubées pendant 15 h à 37°C avec 0,25 mU de PNGase A, dans 100 µl.
Ce test a été répété deux fois dans des conditions proches avec un temps d’incubation plus long. Les résultats ont été similaires et n’ont pas permis de tirer une conclusion précise. En effet, s’il ne démontre pas la présence de N-glycannes, ce résultat n’en
α(1 $6 )' β(1,4)' α(1 $3 )' β(1,4)' Asn' α(1 $6 )' α(1 $3)' α(1 $6 )' β(1,4)' α(1 $3 )' β(1,4)' Asn' α(1 $3)' α(1 $6 )' β(1,4)' β(1,4)' Asn' α(1 $6 )' α(1 $3)' α(1 $6 )' β(1,4)' β(1,4)' Asn' α(1 $3)' ≈'60'%';'m'='1,3'kDa' ≈'10'%';'m'='1,1'kDa' ≈'10'%';'m'='1'kDa' ≈'20'%';'m'='1,1'kDa' L$Fucose' N$acétylglucosamine' Asn' Asparagine' Mannose' 75 50 37! kDa M 1 2 3 4 1. AtFuT1 PNGase + 2. AtFuT1 PNGase – 3. Fetuin PNGase – 4. Fetuin PNGase +
démontre pas non plus l’absence. Il est possible que l’enzyme soit inactive ou que les conditions choisies ne lui aient pas permis d’agir efficacement : qu’AtFuT1 s’agrège à ce pH, que du SDS restant inhibe l’action de la PNGase, etc.
Ø Séquençage N-terminal
Pour résoudre le problème de la présence de la bande basse à 58 kDa, un séquençage de la partie « N-ter » des protéines de chacune des deux bandes distinctes sur gel a été entrepris. Cela permet de déterminer si une troncation en N-terminale de la protéine a pu avoir lieu. Le séquençage N-ter des protéines, ou séquençage d’Edman, (EDMAN, 1956) est un processus chimique, cyclique, durant lequel les acides aminés sont clivés un par un et traités pour être identifiés par chromatographie. Les protéines du gel sont transférées en fin de migration sur membrane PVDF et colorées au bleu de Coomassie. Les bandes d’intérêt sont alors découpées et analysées séparément. Cette expérience a été réalisée à la plateforme « séquençage et analyse des acides aminés » de l’Institut de Biologie Structurale de Grenoble. Deux chaînes peptidiques distinctes ont été identifiées (Figure IV.12).
Figure IV.12 : Résultat du séquençage N-terminale des formes purifiées d’AtFuT1
Les acides aminés identifiés à partir de la bande haute (à 62,3 kDa) correspondent à la partie N-terminale de la construction exprimée. Ceux de la bande basse (58-59 kDa) sont les premiers acides aminés de la troncation. His(6) = étiquette poly histidine, EK = site de l’entérokinase et de reconnaissance par l’anticorps X-Press
La partie N-terminale des protéines issues de la bande haute (62 kDa) correspond au début de la construction His-EK- AtFuT1Δ68 et celle de la bande basse à un clivage de cette dernière. De manière surprenante, il s’agit des premiers acides aminés d’AtFuT1 au niveau de la troncation AtFuT1Δ68. Il y a donc bien deux formes distinctes de la même protéine dans l’échantillon purifié. La forme de la bande du bas ne comporte pas l’étiquette (His)6, par laquelle se fait la première purification. Cette observation conforte le fait qu’AtFuT1 est en dimère dans les conditions de l’expérience, car sinon cette forme n’aurait pas pu être retenue sur colonne HisTrap. Cela peut expliquer aussi le fait que la
MRGSHHHH…'' SNRIM…'' 75' 50' 37' kDa' M' Ech' His(6)9EK9AtFUT1Δ68' AtFUT1Δ68'
proportion de chaque bande varie selon les conditions de culture, de purification, ainsi qu’en fonction du gradient d’imidazole.
Ø Bilan des analyses biochimiques
Il est certain que deux formes de la construction His-EK-AtFuT1Δ68 se trouvent dans l’échantillon purifié, dont les masses sont de l’ordre de 58 kDa et 62 kDa. Chaque séquence possède les deux sites de glycosylation potentiels. Leurs masses prédites sur la base des séquences en acides aminés sont respectivement de 55,7 kDa et de 59,7 kDa (serveur protein parameter). Bien que les masses de N-glycannes puissent varier, schématiquement, six combinaisons sont possibles (Figure IV.13). La masse des N-glycannes utilisée pour ces estimations est de 1,2 ± 0,2 kDa, ce qui correspond à plus de 80 % des structures rencontrées sur
les protéines sécrétées à partir de cellules d’insecte High-five (Ding et al., 2003 ; Dojima et al., 2009).
Figure IV.13 : différentes formes possibles d’AtFuT1 dans les échantillons purifiés. Les éléments pris en comptes sont le clivage de l’étiquette du vecteur et la présence de N-glycannes sur les sites prédits. Pour l’hypothèse où un seul glycanne est présent, seule la possibilité de branchement sur le site N-ter est représentée par souci de simplification, mais la masse estimée du glycanne reste la même quelle que soit sa position. Un symbole coche est attribué si la masse de la structure peut correspondre à l’un des deux pics du spectre MALDI-TOF et une croix si celle-ci diffère de plus de 0,5 kDa de l’une des valeurs mesurées (58 - 59 ; 62 kDa).
Les écarts de masses mesurés (3-4
kDa) correspondent davantage à un écart induit par le clivage de la partie N-ter de l’étiquette de la protéine (4 kDa). La masse de 62,3 kDa mesurée par MALDI-TOF correspond vraisemblablement à la forme entière de la construction avec deux glycannes (62,1 ± 0,1 kDa). Celle correspondant à 58 kDa à la forme tronquée avec deux N-glycannes. Masse%es&mée% (kDa)% 59,7% ✗% 60,9%±%0,1% ✗% 62,1%±%0,2% ✔% 55,7% ✗% 56,9%±%0,1% ✗% 58,1%±%0,2% ✔% Forme%possible%