Objectifs du travail de thèse

Bien que la vaccination contre le virus de la fièvre jaune soit très efficace et que les réponses neutralisantes induites soient connues, la connaissance sur la pathogénèse reste limitée. Les données sont généralement obtenues sur des stades tardifs de la pathologie ou sur des modèles in vivo et in vitro qui présentent un certain nombre de limitations. Un ensemble d’études incluant des lignées immortalisées ou des cellules primaires ont été menées pour comparer les infections, les réplications et les réponses induites par les souches sauvages et vaccinales du virus de la fièvre jaune au niveau hépatique. Ces études se sont à l’heure d’aujourd’hui focalisées sur les hépatocytes, les cellules de Kupffer et des cellules endothéliales. Les lignées hépatocytaires sont pour la plupart issues d’hépato carcinomes humains ou immortalisées par le virus SV40. Les lignées HepG2, huh7, PH5CH8 et THLE-3 ont ainsi été utilisées. Si la réplication dans les lignées THLE-3 et huh7 n’a été démontrée qu’avec la souche vaccinale 17D [250], cette dernière se réplique mieux que la souche sauvage Asibi dans les cellules HepG2 [249,250] et inversement dans les cellules PH5CH8 [71]. Des informations contradictoires ont également été observées sur les macrophages U937 et les cellules de Kupffer primaires. La souche YF17D se répliquant mieux que la souche sauvage dans les cellules U937 et inversement dans les cellules de Kupffer [71,72,251]. Enfin une étude sur des cellules endothéliales de la lignée HUVEC, issues d’un cordon ombilical humain, a montré une infectivité supérieure de la souche sauvage Asibi [75].

L’induction des cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-1β, IL-6, l’IL-8, RANTES (CCL5) ou encore le TNF-α et les cytokines anti-inflammatoires comme l’IL-4 et l’IL-10 sont systématiquement induites plus fortement par la souche vaccinale dans les cellules hépatiques Ph5CH8 et HepG2, aux niveaux ARN et protéique [71,249]. En revanche les inductions dans les macrophages et les cellules endothéliales sont supérieures avec la souche sauvage Asibi [72,75]. Ces phénomènes inflammatoires sont également associés à la mise en place d’une réponse IFN. Les cellules HUVEC, infectées par les souches sauvages ou vaccinales voient en effet une transcription augmentée des gènes de réponse aux IFNs comme le gène

76 p78 et le gène Cig5 [75]. L’induction par les cellules endothéliales de l’IL-6 a notamment été étudiée pour

son effet en aval sur les cellules de Kupffer et les hépatocytes. Une pré-stimulation des cellules de Kupffer par l’IL-6 a montré que la souche Asibi induisait une production réduite d’IL-10 et augmentait les productions d’IL-8, de RANTES et de TNF-α. Ce phénotype pro-inflammatoire associé à une limitation des régulations pouvant expliquer la pathologie observée au niveau hépatique [72]. Un phénomène semblable est également observé dans les hépatocytes PH5CH8 suite à une stimulation par l’IL-6. Une diminution de la réplication des deux souches et une limitation des mécanismes régulateurs avec la souche Asibi ont été observées [71].

Compte tenu des dégradations majeures observées au niveau hépatique, les marqueurs de mortalité cellulaire ont également été étudiés dans ces modèles. Si le TGF-β, précédemment décrit comme inducteur d’apoptose au cours de l’infection sauvage [101] n’est pas spécifiquement activé par l’une ou l’autre des souches dans le modèle PH5CH8 [71], des marqueurs précoces d’apoptose ont été décrits avec la souche 17D (IEX-1, IRF-1, DEC-1) dès 1 heure post infection dans les cellules HepG2 [249]. Une variation de l’expression du facteur anti-apoptotique Bcl2 a également été décrite suite à l’infection des cellules HUVEC par la souche 17D [75]. Enfin des éléments de réponse sur les phénomènes de coagulopathies ont été apportés par une étude récente sur les cellules PH5CH8 [73]. Des marqueurs comme le fibrinogène ou le facteur inhibiteur de l’activation du plasminogène (PAI-1), un élément essentiel de la coagulation, sont décrits comme surexprimés dans le contexte infectieux. La pré-stimulation avec l’IL-6 augmentant une fois de plus la transcription de ces facteurs [73].

Le manque de modèles d’études et la difficulté de suivre les temps précoces ou précédents l’infection hépatique limitent effectivement la compréhension des mécanismes associés. Par ailleurs si des études distinctes ont démontrées l’effet de l’infection sur les hépatocytes, les cellules de Kupffer ou encore les

77 cellules endothéliales, l’interaction de ces populations cellulaires demeure hypothétique dans ce

contexte infectieux.

Afin de mieux comprendre le rôle de la réponse innée du foie qui amène dans le futur établissement d’un état antiviral ou pathogène, nous avons mené une étude comparative entre la souche atténuée YFV 17D et la souche sauvage parentale YFV Asibi. Afin d’intégrer la complexité du modèle hépatique, nous avons utilisé différents modèles cellulaires d’étude et en particulier un modèle 3D incluant des hépatocytes primaires et des cellules de Kupffer assemblés par la technologie « gravity drop ». Un modèle d’hépatocytes dérivés de cellules souches embryonnaires a également été utilisé.

Une approche transcriptomique globale a été menée par utilisation des technologies de séquençage et de PCRarray, nécessitant la définition de critères d’analyses de données multiples.

Nous avons focalisé nos objectifs sur l’étude de la dynamique des dérégulations immunitaires, cellulaires et métaboliques induites par les deux virus, l’identification de signatures spécifiques de chacune des souches et la compréhension des réponses immunitaires hépatiques avec la volonté de proposer un modèle et des tests permettant la caractérisation et la compréhension ultérieures de nouveaux candidats vaccins

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