Bien qu’étudiés depuis maintenant longtemps, la plasticité synaptique et les mécanismes moléculaires la régissant sont encore très mal compris. Une des principales difficultés consiste à relier la multitude de voies biochimiques, individuellement découvertes et étudiées, en un modèle unifié. Les enregistrements électrophysiologiques, bien que très utiles, ne donnent qu’une image incomplète de cette plasticité et ne permettent pas d’identifier robustement, à l’intérieur de chaque épine individuelle, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la plasticité.
Mon objectif principal a donc été d’étudier les mécanismes moléculaires de la plasticité synaptique à l’aide de techniques alternatives à l’électrophysiologie. La première étape de mon projet de recherche a donc été de développer un protocole de vidéo-microscopie en fluorescence permettant de mesurer l’activité neuronale directement dans les épines synaptiques, à l'aide de senseurs de Ca2+ génétiquement encodés introduits par transfert de gènes dans des neurones de l'hippocampe en culture. Grâce à ces mesures, j’ai observé que l'activité synaptique spontanée provoque des oscillations de Ca2+ dans les épines. Ces oscillations calciques démontrent de la plasticité à long terme en augmentant en amplitude et fréquence, suite à une forte stimulation synaptique. Cette nouvelle forme de plasticité, encore inconnue, présente à la fois des caractéristiques pré et postsynaptiques, suggérant la contribution de plusieurs mécanismes distincts. Comme second objectif, j’ai donc tenté d’élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans la plasticité que j’ai observée. Mes hypothèses sont que l’augmentation de la fréquence et de l’amplitude des oscillations de Ca2+ résulte d’une combinaison de changements moléculaires dans le bouton présynaptique et l’épine postsynaptique, se traduisant par une augmentation ou une réorganisation des récepteurs au glutamate de type AMPA et/ou NMDA ou par un changement de leurs sous-unités les rendant plus perméable au Ca2+, et de changements dans la probabilité de libération de neurotransmetteurs dans le bouton présynaptique.
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Chapitre 2
Méthodologie
2.1 Culture cellulaire
J’ai utilisé des cultures primaires de neurones d’hippocampes de rats comme modèle expérimental tout au long de mon projet de maîtrise. Comme la préparation de cultures primaires nécessite beaucoup de temps et d’habiletés, le protocole décrit dans cette section a été effectué exclusivement par Francine Nault, Charleen Salesse et Laurence Émond. En premier lieu, l’hippocampe de rats P0 à P2 est extrait et ses cellules sont dissociées enzymatiquement (Papain, 12U/mL) et mécaniquement (Trituration par pipette Pasteur). Les cellules dissociées sont alors lavées et centrifugées dans une solution de Neurobasal. Elles sont ensuite déposées par gravité sur lamelles d’Aclar (12mm) ou de verre (18mm) préalablement recouvertes de Poly-D-Lysine, à une densité d’environ 650 cellules/mm2. Le milieu de culture est composé de Neurobasal complet (Neurobasal additionné de B27 (50:1)), complété de penicillin/streptomycin (50 U/ml; 50 µg/ml) et de Glutamax (0.5mM, Invitrogen). Du sérum bovin fœtal (2%) a également été ajouté au moment d’ensemencer les cellules sur lamelle. 5 jours suivant la mise en culture, la moitié du milieu de culture est remplacée par du milieu frais sans sérum et additionné de 5µM 1-β-D-cytosine-arabinofuranoside (Ara-C; Sigma-Aldrich). Par la suite, le milieu de culture est remplacé de moitié deux fois par semaine, sans sérum ni Ara-C.
2.2 Transfection
Les neurones dissociés ont été transfectés par Lipofectamine® 2000 (ThermoFisher) entre les jours in vitro 11 et 14. La lipofectamine est un agent lipidique qui forme naturellement des liposomes cationiques lorsque mise en solution. Leur nature cationique favorise non seulement la formation de complexes avec des molécules chargées négativement, telles que l’acide désoxyribonucléique (ADN), mais également la fusion de ceux-ci avec les membranes plasmiques, rendant la lipofectamine très utile pour la livraison de molécules normalement imperméables à la membrane.
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Les neurones dissociés ont été transfectés avec un large éventail de plasmides circulaires contenant les gènes d’intérêts. Sauf exception, le protocole de transfection est le même pour tous les plasmides, et ce qui suit concerne spécifiquement la transfection sur lamelle d’Aclar (dans le cas de lamelle de verre, tous les volumes/quantités sont doublés). La première étape consiste à préparer un nouveau milieu de culture pour la transfection. 500 µL de milieu de culture est prélevé par puit de lamelle, et un volume équivalent (1:1) de Neurobasal complet y est ajouté. La moitié de ce mélange (50% vieux milieu / 50% nouveau milieu) est ensuite distribuée dans de nouveaux puits où la transfection aura lieu, et l’autre moitié dans des puits de transfert post-transfection (500µ L/puits). Pour chaque lamelle transfectée, 0.5µg d’ADN plasmidique et 2µL de lipofectamine® sont mélangés à 50µL de Neurobasal frais, puis le mélange est déposé, goutte par goutte, dans un puits de transfection où une lamelle a préalablement été transférée. La préparation est ensuite incubée 3-4h, puis les lamelles sont transférées dans leur puit de transfert. Le temps de surexpression varie d’un plasmide à l’autre, allant de ~24h pour les indicateurs de calcium (GCaMP,jRGECO) jusqu’à 7 jours pour certains plasmides autorégulés (intracorps FingR).
J’ai utilisé plusieurs constructions de plasmide durant ma maîtrise. Dans la majorité des expériences présentées dans ce mémoire, j’ai utilisé un indicateur de calcium génétiquement encodé. J’ai initialement commencé avec GCaMP5 pour rapidement changer aux variantes rapide (f, fast) et lente (s, slow) de GCaMP6. Bien que GCaMP5 représente une grande amélioration comparativement à son homologue GCaMP3, l’arrivée de GCaMP6 a vite fait éclipsé tout autre indicateur de calcium, ses propriétés cinétiques et son niveau de fluorescence étant de loin les meilleures (T. W. Chen et al., 2013). Ayant commencé avec CMV-GCaMP6f, j’ai été conseillé de changer au CMV-GCaMP6s afin de m’assurer de ne pas manquer des événements calciques dû à mon acquisition d’image relativement lente. Cependant, en modifiant certains paramètres d’acquisition, je crois que GCaMP6f est la meilleure option, car il possède une cinétique rapide qui me permet d’avoir une idée plus réelle de la cinétique de calcium. GCaMP6f, tout comme ces variantes, est idéalement surexprimé pour un maximum de 24h. Il est possible d’aller jusqu’à 72h, mais la santé des cultures en est visiblement affectée. NES-jRGECO, le nouvel homologue rouge de GCaMP6, a été utilisé selon le protocole standard. pCAG-PSD95-FingR-GFP (gracieuseté de Don Arnold) est transfecté selon le protocole standard, mais il est recommandé, dû à son autorégulation, de le laisser surexprimer quelques jours.
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Une surexpression d’aussi peu que 24h est suffisante pour observer le marqueur, mais les résultats sont optimisés vers 3-4 jours. iGluSnFR a été transfecté sur verre, selon le protocole standard.