Libération de glutamate

L’imagerie de MSCTs est une méthode sensible pour mesurer l’activité postsynaptique. C’est une lecture indirecte de la libération de neurotransmetteurs, car ces MSCTs sont générés par l’ouverture de récepteurs à glutamate. Cependant, dans un contexte de plasticité, où une hausse de la fréquence de cette ouverture de récepteurs est observée, l’imagerie de MSCTs devient limitante dans le sens qu’elle ne permet pas d’investiguer directement la libération de glutamate. Il n’est donc pas possible, en utilisant uniquement l’imagerie des MSCTs, de conclure en des modifications présynaptiques. Heureusement, les récentes avancées technologiques en biophotonique ont mené à la création d’une nouvelle catégorie de senseurs fluorescents, les senseurs à neurotransmetteurs. Selon des principes similaires aux indicateurs de Ca2+_{, ces senseurs, lorsque liés à un} neurotransmetteur spécifique, subissent un changement de conformation qui favorise leur émission de fluorescence. Le nouveau senseur à glutamate, iGluSnFR (intensity-based glutamate-sensing fluorescent reporter), est très prometteur (Marvin et al., 2013). L’idée ici était que si ce senseur est assez sensible pour détecter la libération quantique de glutamate, il pourrait permettre de directement mesurer des changements dans la probabilité de l de neurotransmetteurs. J’ai donc transfecté les neurones pour qu’ils surexpriment iGluSnFR, et procédé à l’imagerie sur un microscope de type TIRF (Total internal reflection fluorescence microscope). La principale raison d’avoir utilisé le TIRF plutôt qu’un microscope standard à fluorescence est que le premier est équipé d’un laser plus puissant, permettant l’acquisition très rapide d’images.

Afin de bien caractériser iGluSnFR, j’ai procédé à plusieurs expérimentations. Premièrement, lorsque dans une solution d’ACSF standard, il est possible, sur certains neurones, d’observer une augmentation de fluorescence globale périodique (Fig.3.16c). On pourrait facilement s’imaginer que cette hausse globale reflète un potentiel d’action, par contre il est un peu étonnant, à bien y penser, d’observer une hausse globale de la fluorescence, partout sur le neurone. Cela laisse en effet supposer une libération simultanée de glutamate dans tout l’environnement du neurone imagé, ce qui, malgré la haute densité cellulaire, serait étonnant. On peut donc supposer qu’un rapide débordement (spillover) de glutamate provoque ce phénomène. Peu importe la raison, il est difficile de comprendre clairement ce phénomène, mais du moins ce dernier nous indique qu’iGluSnFR est capable de se lier à un ligand et d’émettre de la fluorescence. À noter que ce phénomène n’est pas observable sur tous les neurones, certains ne présentant aucune hausse spontanée de fluorescence.

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Pour déterminer si c’est bien du glutamate qui génère ces hausses globales de fluorescence, j’ai injecté du glutamate (100µM) directement au-dessus des cellules, et j’ai observé une hausse transitoire de la fluorescence (Fig.3.16d). Il semble donc qu’iGluSnFR détecte réellement le glutamate. Cependant, comme l’intérêt de l’outil réside dans sa capacité de détecter la libération quantique de glutamate, j’ai imagé le senseur sous une perfusion de 0Mg2+_{/TTX. Malheureusement,} sous cette condition, même en doublant la concentration de Ca2+_{, je n’ai jamais été en mesure de} détecter des hausses locales de fluorescence. En présence de TTX, toute augmentation globale cesse, et aucune fluctuation de signal n’est perçue. Même en présence de l’indicateur de Ca2+ jRGECO, il n’est pas possible de détecter une corrélation entre le signal de ce dernier et celui de iGluSnFR (Fig.3.16e). Cette décevante constatation n’a également pas changé lorsque j’ai ajouté du TBOA (50µM), un bloqueur compétitif des transporteurs de glutamate. Ainsi, bien qu’iGluSnFR semble être un bon outil de détection de relâchements de glutamate causés par des potentiels d’action, il semble que la libération quantique de glutamate n’est pas suffisant pour générer une hausse de fluorescence détectable.

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Figure 3.16. Imagerie de glutamate avec l’indicateur fluorescent iGluSnFR. (A) Neurones surexprimant iGluSnFR.

(B) Kymographe du signal de fluorescence généré à partir du tracé rouge en (A). L’axe vertical correspond au temps. (C) Tracé du signal de fluorescence de la région rectangulaire jaune en (A). (D) Tracé de fluorescence d’une cellule exprimant iGluSnFR sur lequel du glutamate (100µM) est injecté de façon périodique de façon automatisée. (E) Tracés du signal quasi simultané de jRGECO (rouge, axe de gauche) et d’iGluSnFR (vert, axe de droite) superposés.

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Chapitre 4

Discussion

Dans ce projet de maîtrise, j’ai utilisé des outils optiques dans le but de mieux comprendre certains mécanismes de la plasticité synaptique dans des neurones en cultures. Plus précisément, j’ai optimisé une méthode d’observation optique de la plasticité synaptique, et par le fait même tenté d’en élucider certains mécanismes. Les influx synaptiques miniatures de calcium ont été très peu caractérisés dans le passé, et jamais il n’avait été montré qu’il était possible de les potentialiser. Avec ce protocole d’induction de plasticité des influx calciques miniatures que j’ai développé, j’espère avoir réussi à démontrer l’intérêt que ce phénomène représente.

Contrairement à la plupart des études en recherche médicale, mon projet de maîtrise a été bâti sans réellement définir d’hypothèse biologique de départ. L’idée était qu’avec l’arrivée de nouveaux senseurs fluorescents génétiquement encodés, il serait possible de reproduire plus efficacement certains phénomènes précédemment démontrés, mais très peu exploités. Voyant rapidement que les senseurs GCaMP de nouvelles générations (GCaMP5 et GCaMP6) permettaient une détection très sensible de Ca2+_{, nous avons vite perçu l’intérêt qu’ils présentaient pour l’étude des influx calciques} miniatures. C’est après avoir vérifié l’hypothèse que ces influx calciques pourraient être potentialisés que tout le projet a été conçu. Au départ, la détection de MSCTs à l’aide de GCaMP était avant tout une méthode simple de visualisation de l’activité synaptique. Ce n’est qu’après avoir compris que le phénomène présentait en soi un intérêt biologique que nous avons commencé à nous intéresser à la mécanistique derrière les MSCTs et leur plasticité, ainsi qu’à la physiologie derrière le tout.

Les conditions pour observer les MSCTs sont reproductibles et bien établies. La présence de TTX et l’absence de Mg2+ _{dans la solution de perfusion sont primordiales. Rapidement, des objections quant} à ces conditions sont levées par les biologistes qui s’intéressent à la physiologie des systèmes. La présence de TTX et l’absence de Mg2+ _{ne sont pas physiologiques, et cette condition ne peut être} reproduite en condition in vivo. Ces objections sont fondées. Les MSCTs sont générés en ajoutant des drogues et en manipulant la concentration ionique. Cependant, artéfact ou non, ils sont, en premier lieu, un outil pour visualiser l’activation synaptique. Contrairement aux techniques

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d’électrophysiologie, l’observation de MSCTs permet de détecter directement la localisation de l’input synaptique. Ainsi, il est important de voir les MSCTs comme un outil de détection.

Cependant, malgré les conditions artificielles requises pour l’observation des MSCTs, il faut garder en tête que si ces influx calciques sont présents, c’est qu’ils découlent d’un phénomène physiologique qui n’est pas un artéfact, soit la libération spontanée de neurotransmetteurs. Comme il a été détaillé dans l’introduction, la libération spontanée de neurotransmetteur est un phénomène qui a été mis en évidence durant les premières études sur l’activité neuronale (Fatt & Katz, 1952; Kavalali, 2015). Ces travaux avaient alors proposé l’hypothèse quantique, selon laquelle les neurotransmetteurs sont relâchés par quanta, qui représente la quantité de neurotransmetteurs relâchée par une vésicule présynaptique. Cependant, alors que l’attention s’est toujours principalement portée sur la libération synchronisée de neurotransmetteurs évoquée par les potentiels d’action, la libération spontanée de quantum de neurotransmetteurs de façon spontanée a longtemps été considéré comme sans importance physiologique, voir comme un artéfact. Or, de plus en plus d’études démontrent l’importance de ces relâchements spontanés et leur indépendance moléculaire vis-à-vis la libération évoquée (Kavalali, 2015). La libération spontanée d’un quanta de neurotransmetteur peut générer un potentiel postsynaptique excitateur miniature, ce qui entraîne une entrée d’ions, dont le Ca2+_{. Les MSCTs correspondent à ces entrées de Ca}2+_{. Afin d’étudier les} potentiels postsynaptiques miniatures, les électrophysiologistes ont souvent recours à des drogues telles que le TTX, sans quoi ces petits courants sont difficilement détectables au travers des potentiels d’action. Similairement, sans présence de TTX, on ne peut observer ces élévations calciques miniatures, à cause des fortes hausses de fluorescence dans tout le neurone. Également, les courants miniatures mesurés par électrophysiologie sont générés par une variété de récepteurs/canaux ioniques. Dans les faits, la majorité des courants mesurés sont générés par les transferts ioniques au travers des rAMPA, ce qui représente une différence notable entre mes observations et celles d’un électrophysiologiste, du fait que j’observe uniquement des influx calciques générés par l’ouverture des récepteurs NMDA. Ceci justifie la nécessité de ne pas avoir de Mg2+ dans la perfusion.

La libération spontanée de quanta de neurotransmetteur est un phénomène quasi stochastique, à savoir un phénomène aléatoire qui ne dépend d’aucun stimulus et qui découle d’une très faible probabilité de changements conformationnels de la machinerie de fusion des vésicules (Kavalali,

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2015). Cette stochasticité est par le fait même applicable aux mesures de MSCTS. Cela a plusieurs implications. Premièrement, le fait de prendre des mesures très aléatoires et également relativement peu fréquentes oblige de prendre un échantillonnage par vidéo-microscopie relativement grand, sans quoi les résultats ne seraient pas nécessairement représentatifs. C’est ce qui m’a motivé à prendre des acquisitions en continu de plusieurs secondes (45 à 90 secondes, selon les expériences). C’est également pour contrer la variabilité occasionnée par cette stochasticité que j’ai fini par toujours prendre deux mesures de l’activité basale, pour m’assurer d’avoir des résultats fiables et représentatifs. Une autre conséquence du caractère aléatoire des MSCTs est l’obligation d’imager un champ de vue relativement large. Avant l’arrivée des nouvelles générations d’indicateurs de calcium génétiquement encodés et des systèmes électroniques permettant une acquisition rapide, il était plus fréquent de voir des études où seul un segment de dendrite était imagé. Ce genre d’expérimentation, spatialement limitée, diminue grandement les chances de mesurer un phénomène aléatoire tel qu’un MSCT. Finalement, encore en lien avec le caractère aléatoire des mesures de MSCTs, il a fallu, et il faudra encore augmenter la quantité de neurones imagés. Les MSCTs sont un phénomène très variable, et leur plasticité l’est encore plus. La plupart de mes expériences ont été faites en moyenne avec des échantillons d’environ 10-12 neurones par condition, mais clairement ce n’est pas suffisant pour atteindre des seuils statistiquement significatifs. Même si la tendance d’un effet particulier est souvent présente, un échantillon plus élevé, environ 20 neurones, est nécessaire.

Une façon intéressante de mieux caractériser les MSCTs serait de combiner leur observation avec des mesures d’électrophysiologie. Il serait en effet très pertinent de connaître la relation entre les influx observés et les traces normalement obtenus en électrophysiologie. Bien que je n’aie pas de telles mesures, je crois probable que les influx calciques observés concorderaient avec les plus gros courants mesurés par électrophysiologie. En effet, l’électrophysiologie, malgré ses défauts, reste une technique très sensible à tout changement, et il faut s’attendre à ce que les plus petits courants causés par les rNMDA ne soient pas détectables optiquement, à cause d’une trop faible entrée de calcium. Mon hypothèse est cependant partiellement infirmée par une précédente étude de Tim Murphy où, en combinant la mesure optique d’influx optiques avec des enregistrements électrophysiologiques, les auteurs ont démontré que les MSCTs pouvaient être associés aux plus petits courants miniatures postsynaptiques mesurés. L’observation de MSCTs a cependant été faite avec le senseur organique Fura-2, qui est beaucoup plus sensible au Ca2+ _{que GCaMP6f (T. H.} Murphy et al., 1995).

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Comme je l’ai démontré, les MSCTs présentent des morphologies très variables. Bien que j’aie toujours analysé tous les MSCTs sans discrimination morphologique, je suis conscient qu’il serait intéressant de comparer les diverses propriétés selon leur type. Il est clair que les influx locaux et les influx diffus ne sont pas générés dans le même type d’environnement. Les MSCTs locaux sont localisés dans des épines postsynaptiques en forme de champignon (mushroom shape dendritic spine). Bien que l’on ne connaisse pas encore le rôle exact de ces épines, on sait maintenant que leur cou exerce une forte contrainte biophysique pour les molécules en diffusion libre, en plus d’offrir une résistance électrique (Araya, 2014). Il semble donc que les ions Ca2+_{, en plus des molécules} GCaMPs, présents dans l’épine postsynaptique soient trappés dans cet environnement, limitant ainsi la diffusion de l’influx. Les MSCTs diffus, eux, sont moins facilement caractérisables, car ils présentent des degrés de diffusion très variables. Dans tous les cas, il semble qu’ils soient générés dans des sites très peu compartimentalisés, tels que des épines trapues (stubby spines), qui ne possèdent pas vraiment de cou, mais qui sont plutôt des renflements de la dendrite. Les ions entrants et liés à la protéine GCaMP sont donc relativement libres de diffuser dans la dendrite. Les conséquences de telles différences ne sont pas le sujet de ce mémoire, mais il est bon de garder en tête que je n’ai pas fait de distinctions entre les deux types de MSCTs dans mes analyses. Cela pourrait avoir des conséquences sur l’interprétation de mes résultats, si par exemple la potentialisation des MSCTs se faisait différemment selon la façon dont le Ca2+ _{est compartimentalisé.} Cette possibilité a d’ailleurs récemment fait l’objet d’une étude, où il a été démontré que la compartimentalisation des influx calciques reflète la maturité des synapses, et que la diffusion du Ca2+ _{dans les synapses immatures avait un impact sur la plasticité des synapses environnantes (K.} F. Lee, Soares, Thivierge, & Beique, 2016). En effet, en stimulant par glutamate uncaging, les auteurs ont montré que la diffusion du Ca2+_{, dépendante des réserves internes de Ca}2+_{, avait un rôle} coopératif sur la plasticité des synapses environnantes. Ainsi, il se pourrait que les différents types de MSCTs que j’observe proviennent de synapses de différentes maturités, et donc que les mécanismes sous-jacents à leur plasticité diffèrent, comme récemment revu par MacDougall et Fine (MacDougall & Fine, 2014). Une solution relativement simple pour contrevenir à ce problème serait l’implémentation d’une détection automatisée du type de MSCT basée sur sa forme et sur son excentricité.

Une des premières étapes dans mon projet de maîtrise a été de bien caractériser les influx calciques que j’observais. Bien que plusieurs indices nous indiquent que j’observais bien les MSCTs

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précédemment décrits par Tim Muprhy, une réelle caractérisation était nécessaire. J’ai donc commencé par m’assurer que les influx étaient réellement générés à la synapse. Pour ce faire, plusieurs stratégies étaient envisageables. J’ai opté pour l’utilisation d’un outil qui venait d’arriver dans notre laboratoire, les intracorps FingR (Gross et al., 2013). Ces protéines fluorescentes génétiquement encodables ont la capacité de se lier à certaines protéines d’intérêts à la façon d’un anticorps. Cela permet donc le marquage, dans les cellules vivantes, de protéines d’intérêts endogènes. Cette propriété de marquer des protéines endogènes est un avantage intéressant comparativement aux techniques standards de surexpression, car elle permet de ne pas modifier la physiologie des neurones. En effet, il est connu que la surexpression de protéine d’échafaudage (i.e. PSD-95) engendre leur regroupement en grappes (clustering) et induit de la potentialisation synaptique (Beique & Andrade, 2003; El-Husseini, Schnell, Chetkovich, Nicoll, & Bredt, 2000). Le fait que j’aie eu accès à un intracorps FingR liant PSD95 est une réelle chance pour moi, car ça m’a permis de mesurer la colocalisation entre les MSCTs et les sites postsynaptiques sans avoir à surexprimer une protéine fluorescente postsynaptique. Ceci faisant, j’ai pu confirmer que les influx calciques miniatures correspondaient bien à l’ouverture de canaux synaptiques. Tout comme ce qui avait été démontré par le passé, les MSCTs que j’ai observés sont bien générés par l’ouverture des rNMDA, comme la démontré l’effet de l’ajout d’APV sur la fréquence des influx. Le fait cependant que les quelques influx restants ont une amplitude relativement inchangée est très intéressant et informatif. Ça suggère que les MSCTs que je perçois en temps normal sont probablement générés par l’ouverture d’un très petit nombre de rNMDA. En effet, lors de l’ajout d’un antagoniste aux rNMDA, les quelques rNMDA non-bloqués, soit par inefficacité de la drogue ou par une résistance de certains sous-types de récepteurs, sont en mesure de générer des élévations de Ca2+ _{similaires aux} élévations dans des conditions sans drogues.

Les rAMPA, principaux contributeurs aux potentiels miniatures postsynaptiques, ont la capacité d’être perméables au Ca2+ _{lorsqu’ils ne contiennent pas de sous-unité GluA2. Leur présence n’ayant jamais} été réellement évaluée dans nos cultures neuronales, j’ai simplement bloqué tous les rAMPA pour voir l’effet sur les MSCTs. Comme je n’ai observé aucune différence, on peut s’imaginer que les rAMPA présents aux synapses sont en grande partie composés de la sous-unité GluA2. Ces résultats concordent avec une étude suggérant que le nombre de rAMPA contenant une sous-unité GluA2 dans les neurones en culture augmente rapidement durant le développement, pour atteindre un plateau vers 14-20 jours in vitro (Pickard, Noel, Henley, Collingridge, & Molnar, 2000). Outre les

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récepteurs au glutamate, les canaux calciques dépendants au voltage auraient pu être une source d’influx calciques miniatures. Cependant, si tel était le cas, il faudrait que le potentiel membranaire à la synapse soit suffisamment dépolarisé pour permettre leur ouverture. Dans un contexte d’inhibition de l’activité neuronale par TTX, ce serait étonnant. Tout de même, j’ai tenté de les bloquer pour observer l’effet sur les MSCTs. Comme je l’ai démontré, la fréquence des MSCTs est diminuée en présence de Cadmium. Ce résultat est très ambigu, car il n’indique pas clairement si les canaux calciques postsynaptiques sont réellement nécessaires pour générer ou amplifier l’influx postsynaptique de Ca2+_{. L’effet observé sur la fréquence, par la seule analyse de mes données,} pourrait s’expliquer autant par un effet postsynaptique que par un effet présynaptique. De fait, le rôle du Ca2+ _{dans la libération spontanée de neurotransmetteurs est très ambigu (Glitsch, 2008; Groffen} et al., 2010; Kavalali, 2015; Vyleta & Smith, 2011). Bien que plusieurs études suggèrent qu’une source de Ca2+ _{est essentielle à la génération de l’exocytose spontané des vésicules contenant les} neurotransmetteurs, une étude par Vyleta et Smith (Vyleta & Smith, 2011), sur des neurones corticaux, a proposé que la libération spontanée de neurotransmetteurs serait indépendante de tout influx de Ca2+ _{présynaptique, mais dépendante de la concentration de Ca}2+ _{extracellulaire, détectée} par une protéine membranaire. Ces propositions sont basées sur le fait que l’ajout de Cd2+ _n’affecte pas la fréquence des potentiels miniatures postsynaptiques, mais que les changements de la concentration extracellulaire de Ca2+ _{le font. Indirectement, on peut comprendre que l’ajout de Cd}2+ n’affecte pas la libération spontanée de neurotransmetteurs. Les mêmes observations ont été faites dans les neurones de l’hippocampe (Abenavoli et al., 2002; Smith et al., 2012). Si l’on compare ces résultats avec les miens, l’on réalise qu’il se peut que l’effet du Cd2+ _{que j’observe sur la fréquence} des MSCTs soit un effet postsynaptique. Dans ce cas hypothétique, la diminution de la fréquence des MSCTs pourrait s’expliquer soit par un blocage des canaux calciques voltage-dépendant, soit par un effet indésirable du Cd2+ _{sur les rNMDA. Dans tous les cas, les MSCTs restent tout de même} un phénomène initialement dépendant des rNMDA, comme le démontre bien leur dépendance à l’absence de Mg2+_{. Si le Cd}2+ _{bloque spécifiquement les canaux calciques postsynaptiques, c’est} peut-être que ces derniers ont un effet synergique avec les rNMDA, et que sans eux l’influx calcique par ces rNMDA n’est pas détectable optiquement.

Comme il a été mentionné dans la section Résultats, l’imagerie optique d’influx calcique par microspie à champ large n’est pas une très bonne technique pour l’étude de leur cinétique. Plusieurs