3.4 Mécanismes et propriétés de la plasticité des MSCTs
3.4.4 Actions des kinases
En partant des résultats suggérant que l’influx de Ca2+ par les rNMDA soit essentiel à la plasticité des MSCTs, j’ai voulu investiguer les effecteurs en aval de cette entrée de Ca2+. La CaMKII est la première protéine investiguée (Résultats par Mado Lemieux). La CaMKII est très fréquemment mentionnée dans les études de plasticité, car elle a la capacité de décoder la fréquence d’entrée du Ca2+ et donc d’adapter sa réponse selon l’activité synaptique. Ceci en fait donc une suspecte de premier choix quant à la plasticité des MSCTs. Deux protocoles ont été testés afin de confirmer ou infirmer le rôle de la CaMKII. Premièrement, l’inhibiteur sélectif KN-93 a été préincubé 30 minutes dans les puits contenant les lamelles, puis ces dernières ont été imagées selon le protocole de plasticité standard, mais en présence constante de KN-93 (KN-92, un dérivé inactif de la drogue, a été utilisé en contrôle). Étonnamment, une potentialisation des MSCTs a été observée même lorsque la CaMKII était inhibée (Fig.3.12 ; Fréquence : KN92, Moyenne ± SEM Hz, 0.28±0.07, 0.58±0.20, 0.35±0.10, 0.42±0.12; KN93 : Moyenne ± SEM Hz, 0.40±0.24, 1.04±0.34, 0.79±0.25, 0.60±0.16 pour condition basale, +5min, +10min, +15min respectivement. Amplitude : KN92, Moyenne ± SEM, 0.81±0.09, 1.13±0.06, 0.99±0.12, 0.99 ± 0.10; KN93, Moyenne ± SEM, 0.71±0.08, 1.04±0.08, 0.99±0.07, 0.86±0.07. n = 9-15 pour le contrôle positif KN92 et la condition avec KN93 respectivement). Des résultats similaires ont été observés dans des neurones surexprimant l’inhibiteur naturel de la CaMKII, CaMKIIN (Résultats non-présentés). Ceci vient donc exclure le rôle enzymatique de la CaMKII. Il est important cependant de garder en tête que ces résultats n’excluent en rien la possible fonction structurelle que CaMKII pourrait avoir (Kim et al., 2016), car autant en présence de KN93 que de CaMKIIN, la protéine était encore présente à la synapse, seulement son action enzymatique était bloquée.
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Figure 3.12. La plasticité des MSCTs est indépendante de la fonction enzymatique de la CaMKII. (A) Protocole de
stimulation, avec des mesures de MSCTs prises en présence de KN-93 (20µM). Un contrôle avec KN-92 (forme inactive du KN-93) a été utilisé. (B) Fréquence et Amplitude des MSCTs mesurée avant (before) et après (+5, 10, 15 min) la stimulation. Les boîtes vertes correspondent au contrôle avec KN-92 dans la solution de 0Mg/TTX, les boîtes bleues avec KN-93. n = 16-11 pour le contrôle positif et la condition avec KN-93 respectivement. * : p<0.05.
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J’ai ensuite voulu tester la protéine kinase A (PKA). L’étude de la PKA est intéressante par le fait qu’il est possible de l’activer et de la désactiver chimiquement. J’ai premièrement testé l’effet de la drogue H89, un inhibiteur de la PKA, sur les MSCTs. Curieusement, l’amplitude basale des MSCTs, en présence de H89, est diminuée (0.67±0.10 % du niveau basal, après 5 minutes d’application de H89 10µM). Cela est cependant en accord avec des observations démontrant que la PKA favorise la perméabilité des rNMDA (Skeberdis et al., 2006). Pour tester le rôle de la PKA dans la plasticité des MSCTs, je l’ai premièrement inhibée pour voir si son activité est nécessaire à l’induction et l’expression de la plasticité. J’ai bloqué la PKA avec H89 (10µM) durant tout le déroulement du protocole (pré-incubation 30min), afin de déterminer si la protéine était impliquée autant dans l’induction ou l’expression de la plasticité (Fig.3.13). Les résultats semblent indiquer, en termes de fréquence, que le fait de bloquer la PKA durant tout le protocole empêche l’expression stable de la plasticité, étant donné qu’une hausse est seulement observée après 5min, pour ensuite diminuer sous le niveau basal. Aucun effet sur l’amplitude n’a pu être conclu étant donné l’absence de potentialisation même dans les contrôles sans H89.
Figure 3.13. La PKA affecte la stabilité de l’expression de la plasticité des MSCTs. (A) Protocole de stimulation,
avec des mesures de MSCTs prises en présence H89 (10µM). Un contrôle a été utilisé. (B) Fréquence et Amplitude des MSCTs mesurée avant (before) et après la stimulation. Les boîtes vertes correspondent au contrôle sans H89 dans la solution de 0Mg/TTX. n = 15-14. * : p<0.05.
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À l’opposé des tests de blocage de la fonction de PKA, j’ai tenté de l’activer chimiquement afin de déterminer si son activation seule serait suffisante à l’induction de la plasticité. Pour ce faire j’ai utilisé une stratégie précédemment employée qui consiste à perfuser les neurones avec un mélange de Forskolin (10µM), un activateur d’AMPc, et de Rolipram (0.1µM), un inhibiteur de la phosphodiestérase-4 (Otmakhov et al., 2004). Ce mélange permet d’augmenter la concentration intracellulaire d’AMPc, qui à son tour est un activateur entre autres de la PKA, tout en inhibant les sources de dégradation de l’AMPc. Basé sur des études d’électrophysiologie proposant l’importance de l’ouverture des rNMDA dans la plasticité induite par l’activation de la PKA, j’ai appliqué, pendant 10 minutes, une solution avec ou sans Mg2+ et avec ou sans le mélange de Fsk/Roli et comparé la fréquence et l’amplitude pré et post-stimulation (Fig.3.14). La motivation d’activer la PKA en présence ou en absence de Mg2+ dans le protocole s’explique par des démonstrations antérieures où la LTP ne pouvait être induite uniquement en l’absence de Mg2+ (Otmakhov et al., 2004). Comme attendue, aucune augmentation de la fréquence n’est observée à la suite de l’application d’une solution contenant du Mg2+, ni même d’une solution sans Mg2+ (0Mg2+). Une augmentation de la fréquence des MSCTs est cependant observée après l’application de Fsk/Roli, l’effet étant plus prononcé avec la condition 0Mg2+/Fsk/Roli (Mg2+/Fsk/Roli : Moyenne ± SEM Hz, 0.61±0.16,
0.99±0.18, 0.69±0.13, 0.71±0.13; 0Mg2+/Fsk/Roli : Moyenne ± SEM Hz, 0.52±0.10, 1.40±0.23,
0.99±0.18, 0.77±0.19 pour condition basale, +5min, +10min, +15min respectivement. n = 11-20 pour les deux conditions respectivement). Ces résultats nous indiquent que la simple application de Fsk/Roli est suffisante pour induire une plasticité des MSCTs, et que l’effet est accentué par l’ouverture des rNMDA. Aucun effet n’a été observé sur l’amplitude des MSCTs.
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Figure 3.14. L’activation de la PKA dans un milieu sans Mg2+ est suffisante pour induire la plasticité des MSCTs. (A) Protocole de stimulation par une solution 0Mg2+ avec ou sans Fsk/Roli (10µM/0.1µM). (B) Fréquence et Amplitude des MSCTs avant (before) et après (+5, 10, 15 min) la stimulation en présence (bleu) ou absence (vert) de Fsk/Roli. n = 7-11-11-20 pour les conditions Mg2+, 0Mg2+, Mg2+/Fsk/Roli, 0Mg2+/Fsk/Roli respectivement. * : p<0.05.
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