Nouveaux prélèvements

Toujours en collaboration avec le Dr. Thierry Lambert, nous avons obtenu 3 nouveaux prélèvements de patients hémophiles entre avril et septembre 2014. Les premiers prélèvements de patients disponibles au laboratoire étaient issus de biopsies de peau, mais les interventions chirurgicales au cours desquelles sont obtenus ces prélèvements étant peu fréquentes, nous avons demandé à obtenir des prélèvements de sang.

a. Tentative de reprogrammation à partir d’ECFC

A la réception du premier prélèvement de sang, nous avons tenté avec Clara d’isoler les ECFC (Endothélial Colony Forming Cells), qui sont des cellules de type Progéniteurs Endothéliaux Circulants (PEC) qui ont une grande capacité de prolifération clonale et sont particulièrement susceptibles à la reprogrammation440. Nous avons tout d’abord isolé les cellules mononuclées adhérentes (PBMC pour Peripheral Blood Mononuclear Cells) par une étape de Ficoll (fig.27). Nous avons ensuite réalisé un tri CD34+ par billes magnétiques afin d’isoler les cellules souches hématopoïétiques et de congeler les cellules CD34- dont nous pourrions isoler plus tard les lymphocytes ou les érythroblastes, qui sont des cellules potentiellement utilisables pour la reprogrammation. Nous avons ensuite ensemencé les cellules mononuclées, après plusieurs lavages, sur des boîtes précoatées au collagène I, dans un milieu de culture spécifique aux cellules endothéliales.

Figure 27: Principe d'isolement des PBMC à partir d’un prélèvement de sang total.

En théorie, l’isolement d’ECFC est assez simple, mais les chances de succès sont souvent faibles car le nombre d’ECFC est estimé à 0.05-0.2 cellules/ml dans le sang périphérique adulte. Dans cette expérience par exemple, nous n’avons pas obtenu d’ECFC.

102 Afin de maximiser nos chances de réussite, nous avons décidé d’utiliser d’emblée les PBMC, sans isolement des ECFC, pour nos futures expériences de reprogrammation.

b. Tentatives de reprogrammation à partir de PBMC

J’ai reçu en juillet 2014 un second prélèvement de sang de patient à partir duquel j’ai réalisé un ficoll, comme présenté précédemment, et isolé les PBMC. J’ai ainsi obtenu 80x106 PBMC à partir de 40ml de sang. J’ai congelé une grande partie de ces cellules et gardé une autre partie en culture pendant 2 à 3 jours dans un milieu spécifique complémenté en cytokines pour l’expansion des cellules hématopoïétiques. J’ai réalisé le même isolement/congélation sur un dernier prélèvement fin septembre 2014, après obtention de 164x106 PBMC dans 60ml de sang.

Les premiers essais de reprogrammation à l’aide des ARNmm n’ayant pas été concluants, j’ai tenté de reprogrammer ces cellules par deux techniques en parallèle, en utilisant :

- une méthode intégrative, avec des vecteurs lentiviraux polycistroniques OSKM fournis par Vectalys

- une méthode non intégrative, avec des pseudo-particules virales (en anglais Virus-like Particles, VLP) OSKM

i. Essai de reprogrammation par des vecteurs lentiviraux OSKM

J’ai donc utilisé un vecteur lentiviral polycistronique à une multiplicité d’infection (MOI pour Multiplicity Of Infection) de 30 afin de transduire 100.000 PBMC en culture dans du milieu sans sérum SynH, de chez ABCell-Bio complémenté en SCF (c-kit Ligand) (50ng/ml), IL-3 (Interleukine 3) (10ng/ml), EPO (érythropoïétine) (2U/ml), Dexamethasone (1µM) et IGF-1 (insulin-like growth factor-1) (40ng/ml). J’ai réalisé deux transductions de 6 heures, à 24h d’intervalle puis transféré, après 48h de culture, 50.000 cellules transduites sur geltrex et 50.000 sur des cellules nourricières de souris appelées MEF (pour Mouse embryonic fibroblasts). J’ai ensuite séquentiellement changé le milieu de culture SynH pour du milieu de culture pour cellules souches (Nutristem pour les cellules sur Geltrex et milieu KOSR pour les cellules sur MEF).

J’ai pu observer durant les semaines suivantes quelques clusters de cellules débutant un changement morphologique mais le processus n’a pas évolué jusqu’au bout et je n’ai obtenu aucune colonie iPSC.

ii. Essai de reprogrammation par des VLP OSKM

Les VLP, ou pseudo-particules virales, sont des particules virales sans génome, donc incapables de se multiplier et de faire un cycle infectieux complet, mais toujours capables d’entrer dans les cellules avec la même efficacité qu’un virus. Elles sont obtenues par l’assemblage spontané de protéines de la capside d’un virus et pouvant encapsuler des protéines synthétisées par la cellule productrice si ces dernières ont des signaux d’adressage. Elles sont, jusqu’à présent, le plus souvent utilisées en clinique pour la vaccination car elles permettent la libération de leur contenu protéique au sein des cellules sans transfert de matériel génétique.

Afin de mettre au point les conditions de reprogrammation et surtout l’efficacité de transduction des VLP, je disposais de VLP-GFP que j’ai donc utilisées en transduisant des PBMC avec des MOI

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Résultats - Chapitre 2 : Modélisation et correction de l’hémophilie B

croissantes (10, 20, 40 et 80) de VLP-GFP. En me basant sur le protocole mis au point au laboratoire pour la reprogrammation avec les ARNmm, j’ai réalisé une série de trois transductions de VLP tous les deux jours. Après 1, 3 et 6 jours de transduction avec les VLP-GFP, j’ai analysé les cellules en cytométrie en flux. Les résultats sont présentés dans la figure 28. J’ai pu observer que le pourcentage de cellules GFP positives n’était pas proportionnel à la MOI, mais que les MOI 10 et MOI20 ne semblaient pas suffisantes, seulement 10 à 15% des cellules étant positives pour la GFP après 6 jours.

Figure 28: Analyse par cytométrie en flux de cellules PBMC de patient après transduction par des VLP-GFP

De plus, comme le montre la figure 29, très peu de cellules ont adhéré sur MEF et, comme pour l’essai de reprogrammation à l’aide des vecteurs lentiviraux, j’ai pu observer durant les semaines suivantes quelques regroupements de cellules ayant changé de morphologie se former en milieu KOSR mais aucun ressemblant réellement à un clone d’iPSC.

104 Figure 29: Morphologie des cellules PBMC transduites à différentes MOI de VLP-OSKM (Photographies à J2 :

grossissement 4X ; photographies à J6 : grossissement 10X)

J’ai alors réalisé un deuxième essai à l’aide des VLP-OSKM, dans lequel j’ai cette fois transduit mes cellules à 8 reprises, tous les deux jours, aux MOI 40 et 80, toujours en présence de B18R. Cette fois, j’ai passé mes cellules sur Geltrex après 5 jours et utilisé un milieu TeSR-E7 de chez StemCell, milieu sans sérum, optimisé pour la reprogrammation par la méthode des épisomes en feeder-free.

Après 6 jours de transfection, j’ai étalé sur lame une partie des cellules et les ai fixées à la PFA 4% afin de les analyser par immunofluorescence. Comme le montre la figure 30, je n’ai obtenu aucun marquage OCT4 à MOI 40 ni à MOI 80. OCT4 étant un acteur clé de la reprogrammation, ces résultats ne présageaient rien de bon pour la suite de la manipulation et en effet je n’ai pu, malgré 8 transductions successives, obtenir aucune colonie iPSC.

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Résultats - Chapitre 2 : Modélisation et correction de l’hémophilie B

Figure 30: Analyses par immunofluorescence des protéines OCT4 et NANOG après cytospin des cellules PBMC

transduites à différentes MOI de VLP-OSKM (20X)

Suite à ces échecs, nous avons décidé de faire appel à un prestataire extérieur pour la reprogrammation par transfection d’épisomes des cellules de patients hémophiles B.

c. Prestataire extérieur

Nous avons donc fourni des échantillons de PBMC isolées à partir des 3 derniers patients hémophiles en notre possession à une entreprise spécialisée dans la reprogrammation de fibroblastes ou de cellules sanguines par une méthode non intégrative. Cependant, malgré leur expertise, confirmée par la reprogrammation réussie de cellules que nous leur avons fournies provenant de patients atteints d’autres pathologies héréditaires, aucun clone iPSC n’a été obtenu non plus entre leurs mains.

Cette « déveine » persistante sera discutée à la fin du manuscrit.

Je me suis donc concentrée pendant le reste de ma thèse sur le seul et unique clone iPSC issu de cellules de patient hémophile B à ma disposition : HB-iPSC.

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II. Différenciation hépatocytaire du clone HB-iPSC

Afin de différencier les iPSC en hépatocytes, j’ai adapté un protocole du laboratoire pour la différenciation de cellules embryonnaires humaines en hépatoblastes441, par l’ajout successif de concentrations choisies de cocktails de facteurs de croissance intervenant lors du développement embryonnaire et fœtal du foie. Les mises au point nécessaires ont été un peu laborieuses car les cellules HB-iPSC sont en fait très sensibles en culture et se différencient très rapidement spontanément. Le protocole que j’ai établi, ainsi que la caractérisation des cellules différenciées, sont présentés dans l’article, à la fin de ce chapitre.

Afin d’apporter la preuve du concept d’une thérapie cellulaire et génique autologue de maladies héréditaires du foie comme l’hémophilie B par la transplantation d’hépatocytes différenciés à partir des cellules iPSC de patients, j’ai ensuite corrigé le défaut génétique des cellules HB-iPSC.

III. Correction génétique