Notion d’espèce en microbiologie

La notion d’espèce est le concept clé et l’unité de base de la taxonomie. La notion d’espèce biologique a sensiblement évolué, depuis l’avènement de la théorie de l’évolution. Selon la définition la plus communément citée, les espèces sont des "groupes de populations naturelles, effectivement ou potentiellement interfécondes, qui sont génétiquement isolées d’autres groupes similaires"(Mayr et al., 1982). Cette définition se prête bien aux organismes eucaryotes, cependant, chez les procaryotes, le concept de reproduction (reproduction végétative et asexuée) est différent. A la différence des eucaryotes, les caractères morphologiques des procaryotes considérés seuls n’ont toujours qu’une faible signification dans la classification des bactéries car la grande majorité des micro-organismes ont des formes trop simples pour que l’on puisse les utiliser pour la taxonomie.

Le développement des techniques moléculaires a permis alors de donner une définition plus rigoureuse de l’espèce. Cette définition est fondée sur les propriétés de dénaturation et de renaturation du double brin de l’ADN génomique bactérien en fonction de la température de dénaturation (Tm) à laquelle l'ADN est présent à 50% sous forme simple brin et à 50% sous forme double brin. Elle permet de définir une espèce procaryotique comme constituée de souches qui présentent des valeurs d’hybridation ADN-ADN supérieures ou égales à 70% et une valeur ∆Tm (différence de température de dénaturation entre l’hybride ADN1-ADN1 et l'hybride ADN1-ADN2) inférieure ou égale à 5°C La généralisation de l’analyse de l’ADNr a incité les auteurs à corréler les pourcentages d’identité entre ARNr 16S et les pourcentages de réassociation ADN-ADN. Ainsi, les séquences d’ADNr ayant des pourcentages d’identités supérieures à 97% sont considérées comme étant des espèces très proches et sont regroupées en Operational Taxonomic Unit (OTU). Ce choix d’un seuil de 97% d’identité est discuté et certains auteurs préfèrent utiliser des seuils de 95, 96 ou 99% (Amann et al., 1995b; Godon et al., 1997).

57 2. Caractérisation de la communauté bactérienne

Différents outils ont été développés afin de comparer les communautés microbiennes. Il existe deux approches pour caractériser une communauté :

- soit l’étude de la diversité d’une communauté, qui consiste à observer la distribution du nombre total d’individus entre les différentes OTUs de la communauté en tenant compte de l’abondance de chaque OTU (selon un seuil choisi).

- soit s’intéresser à la composition en s’intéressant aux profils taxonomiques et leurs affiliations phylogénétiques.

Pour la première approche, MOTHUR est un outil qui permet de regrouper les séquences en OTUs en calculant des matrices de distance et en utilisant un algorithme de regroupement ("clustering algorithm"). Un OTU désigne un groupe de séquences d’acides nucléiques, alignées par position nucléotidique homologue, dont le pourcentage de similarité deux à deux est supérieur à 97%. L’OTU peut être affiliée à une espèce cultivée ou non. Lorsqu’un OTU est non affilié à une espèce connue, il est plus souvent appelé « phylotype ».

Les méthodes basées sur l’analyse des profils taxonomiques permettent d'identifier quels sont les micro-organismes présents. L’étape d’alignement des séquences est une étape déterminante en taxonomie. Elle consiste à mettre en regard les positions homologues des différentes séquences analysées et à comparer, pour chacune de ces positions, des nucléotides présents. Si on prend l’exemple de la molécule d’ARNr 16S, de structure en mosaïque, dans les régions très conservées, les nucléotides homologues sont facilement repérés, alors que dans les régions variables ou hyper-variables, la détection est plus compliquée, surtout si des phénomènes d’insertion ou de délétion sont survenus. L’utilisation des structures secondaires permet d’améliorer l’alignement obtenu, en particulier pour les régions hyper-variables, ainsi que pour les régions où des insertions ou des délétions ont eu lieu. Les régions hyper- variables sont utiles lors de l’étude de séquences appartenant à des genres, espèces ou souches d’une même espèce.

58 3. Bioinformatique au service de la taxonomie

De nombreux logiciels sont disponibles afin de réaliser des opérations sur les séquences d'ADN, de l'assemblage à l'analyse statistique (Schloss, 2008). L'utilisation de ces outils n'est pas toujours aisée. De plus, les étapes de mise en forme des fichiers d'entrée et de sortie de chaque outil sont des opérations délicates et chronophages. Au cours d'une analyse taxonomique, les séquences subissent de nombreuses manipulations réalisées sous environnement UNIX. Ceci nécessite l'apprentissage du fonctionnement de ce système d'exploitation ainsi qu'un certain nombre de commandes.

Dans le cadre de cette étude, plusieurs scripts ont été mis au point afin de rendre plus aisé le maniement d'un grand nombre de séquences. Par ailleurs, nous avons bénéficié pour cette étude d'un cluster de calcul disponible à la plateforme bioinformatique de Toulouse, ce qui a permis de réaliser rapidement des calculs complexes sur un grand nombre de séquences.

Plusieurs bases de données sont disponibles afin d'effectuer des comparaisons de séquences: - Base RDP (Maidak et al., 1994) http://rdp.cme.msu.edu/: C’est une base de 1 921 179

séquences du gène de l'ARNr 16S couvrant essentiellement le domaine Bacteria, dans laquelle il n’y a pas de tri sur la longueur des séquences.

- Base Greengenes (DeSantis et al., 2006) http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph- index.cgi: C’est une base de 1 021 768 séquences du gène de l'ARNr 16S de plus de 1250 bases, affiliées phylogénétiquement. Un alignement est également disponible. Cette base présente l'avantage de proposer des séquences du domaine Archaea.

- Base SILVA (Pruesse et al., 2007) http://www.arb-silva.de/: C’est une base de séquences des gènes des ARNr 16S et 23S. La base de l'ARNr 16S de plus de 900 bases contient actuellement 555 530 séquences.

Les inventaires moléculaires enrichissent de jour en jour la bibliographie scientifique, analysant la diversité microbienne des écosystèmes, du plus exotique aux plus communs (sol, mer, océan, lac et rivière). Ils ont permis d’enrichir nos connaissances sur la compréhension des écosystèmes microbiens, jusqu’alors limitées. Ils résultent de l’enrichissement croissant des bases de données par les séquences trouvées. Dans cette étude nous avons privilégié la base SILVA en raison de la qualité et de la longueur des séquences fournies ainsi que les différentes affiliations phylogénétiques disponibles.

59 Le développement des techniques de séquençage à haut débit est un moyen d’investigation rapide sur les bactéries ruminales, qui apparaissent très dépendantes de l’alimentation des animaux et des conditions du milieu. Ces méthodes peuvent nous aider considérablement à progresser dans la compréhension de l’écosystème ruminal et son fonctionnement notamment dans la digestion des lipides.

60