MATÉRIELS ET MÉTHODES COMMUNS
II. Méthodes analytiques : acides gras, communauté bactérienne
2. Analyse de la communauté bacétrienne des contenus ruminaux et des cultures in vitro
a. Extraction des ADN totaux
L’extraction de l’ADN total a été réalisée à l’aide du kit QIAamp® DNA Stool Mini après une étape de lyse mécanique par beadbeating (FastPrep). Il s’agissait dans un premier temps de procéder à la lyse des cellules par choc thermique (95°C) et chimique, puis d’éliminer les impuretés et enfin de précipiter et purifier l’ADN total. L’ADN ainsi extrait (50 µl à partir d’environ 200 mg d’échantillon) était conservé à -20°C.
b. Électrophorèse capillaire du polymorphisme de conformation simple brin
Les fragments d’ADN amplifiés correspondaient à la région variable V3 (environ 200 paires de bases) de l’ADNr 16S. Les amorces universelles bactériennes qui ont été utilisées sont la W49 et la W104* (Sigma Proligo, France). L’amorce W104*, marquée par un fluorochrome (6-Fam) à son extrémité 5', assure la détection ultérieure d’un des deux brins d’ADN présents dans l’échantillon lors de l’analyse SSCP. L'enzyme utilisée pour la réaction de la PCR était la polymérase Isis DNA Polymerase (MP Biomedicals, Illkirch, France).
102 Les volumes des réactifs de PCR et d’ADN utilisés sont mentionnés dans le tableau 11. Le tableau 12 indique le programme de température utilisé lors de l’amplification.
Tableau 11. Volumes de réactifs utilisés pour la réalisation de la PCR
Volume par tube (µl)
H2O (milliQ) 38
Tampon Pfu Ultra 10X 5
BSA (10 mg/ml) 2,5 dNTP (40 mM) 1 W49 (10 µM) 1 W104* (10 µM) 1 Isis polymerase 0,5 ADN (dilué au 1/200) 1
Tableau 12. Paramètres des réactions de la PCR
Etapes Programme
Température Durée
Dénaturation 94°C 2 min
Hybridation 61°C 15 s
Elongation 72°C 15 s
103 Pour la préparation des amplicons, 1 µl de produit PCR a été mélangé à 9 µl d’un mélange de formamide désionisé (Genescan, Applied Biosystems) qui est un agent dénaturant et du standard interne (Rox 400HD, Genescan-Applied Biosystems) permettant ainsi de comparer les profils entre eux. Après une étape de dénaturation de l’ADN, les molécules ont été séparées par électrophorèse sur un séquenceur (ABI Prism 3100 Genetic Anlyser, Applied Biosystem, USA) et détectées grâce à leur marqueur fluorescent.
L’électrophorèse a fourni un chromatogramme contenant un signal de l’échantillon et le signal du standard interne. La représentation de la communauté bactérienne s’étalait sur 1200 scans. Une co-migration des produits de PCR se produit lors de l’électrophorèse capillaire, par conséquent, un seul pic ne peut pas être considéré comme une espèce bactérienne mais à un assemblage d’OTU. Les profils CE-SSCP ont été alignés et normalisés en utilisant le programme StatFingerprints développé au sein de notre équipe par Michelland et al. (2009).
c. Pyroséquençage 454 GS FLX : analyse des séquences d’ADNr 16S
Après extraction de l’ADN total, une PCR a été réalisée en ciblant deux régions variables (V3 et V4 faisant 440 paires de bases) de l’ADNr 16S. Le choix de ces régions a été réalisé en tenant compte de la taille maximum compatible avec le séquenceur (environ 450 bases). La PCR est un peu particulière puisque des étiquettes ou « MID » (séquences de 10 nucléotides) ont été collées au bout de chaque amorce. Sachant que tous les échantillons ont été mélangés dans un seul tube pour être séquencés, ces MID nous ont permis de reconnaître nos échantillons par la suite. Concrètement, pour les 50 échantillons, 50 PCR ont été réalisées en utilisant 50 couples d’amorces. Ces échantillons ont été ensuite séquencés par pyroséquençage GS FLX 454 (LC 480, Roche, France) à la plateforme génomique « genotoul » de l’INRA de Toulouse.
104 Les séquences brutes issues du séquenceur sont d’abord triées par échantillon (chaque séquence est identifiée par une étiquette). L’analyse des données est réalisée suivant un pipeline (développé au sein de notre équipe en collaboration avec la plateforme bioinformatique de Toulouse et une bioinformaticienne de l’Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse). Ce pipeline se résume en quelques étapes (Figure 11) réalisées sur un cluster de calcul de la plateforme bioinformatique de Toulouse.
Séquences Alignement Matrice de distance Affiliation taxonomique Analyses statistiques Tri des séquences
Répartition en OTU
105 L’étape de nettoyage des séquences consiste à supprimer toutes les séquences qui :
- ont une base non identifiée (N) - sont trop courtes (< 150 bases) - ont des homopolymères1 > 10
- contiennent des amorces qui ont plus de 2 mésappariements
Après nettoyage, 7300 séquences en moyenne ont été obtenues par échantillon. Les séquences supprimées représentent environ 19% des séquences initiales.
Les séquences nettoyées sont ainsi prêtes à être analysées. La première étape consiste à l’alignement des séquences qui se fait sur la base de données SILVA en faisant appel au logiciel MOTHUR.
Après l’alignement, deux approches peuvent être considérées :
Soit un regroupement en OTU après le calcul de matrices de distance entre chaque paire de séquences avec un seuil fixé (0,05, 0,03 ou 0,01). Dans ce cas, deux séquences ayant une distance inférieure au seuil fixé seront considérées comme similaires. Ce seuil reste un choix de discrimination. Pour un seuil de 0,03, les séquences sont considérées comme faisant partie de la même espèce. Pour le seuil 0,05, les séquences sont considérées comme appartenant au même genre et le seuil 0,10 discrimine au niveau de la famille. A partir de ces OTU, des indices de diversité peuvent être calculés.
Soit une affiliation taxonomique des séquences sur la base SILVA 102. Cette analyse des profils taxonomique a permis d’obtenir 360 taxons différents dans les 50 échantillons. L’identification de ces taxons peut aller jusqu’à l’espèce mais c’est très rare. Dans cette analyse, environ 98 % des séquences ont été affiliées à des phylums, 83 % à des familles et 53 % à des genres. Cette affiliation a été réalisée selon un Bootstrap2
= 60%.
Dans notre étude, nous avons fait le choix d’adopter l’affiliation taxonomique des séquences car cette approche semble plus adaptée pour répondre aux objectifs de la partie microbiologique de ce travail c'est-à-dire, l’identification des bactéries impliquées dans la biohydrogénation ruminale du c9,c12-C18:2.
1
homopolymère = segment d'ADN composé d'une base répétée (ex: AAAAAA)
2
107