O fracionamento celular foi realizado conforme o protocolo descrito em Topisrovic et al. (Topisirovic et al. 2003). As células (~3 x 107) foram coletadas e sedimentadas (conforme descrito no item 3.2), em seguida foram lavadas em PBS pH 7,4 gelado, ressuspendidas gentilmente em tampão de lise (Tris pH 8,4 10 mM, NaCl 140 mM, MgCl2 1,5 mM, 0,5%
5 minutos. A eficiência da lise, presença de células intactas versus núcleos livres, foi verificada através da análise de uma alíquota de 1 µL do lisado por microscopia de luz visível, utilizando o microscópio Olympus CKX41. Em seguida, as suspensões celulares foram centrifugadas a 1.000 g durante 5 min a 4 oC e o sobrenadante foi salvo como fração citoplasmática. Os sedimentos (frações nucleares) foram ressuspendidos em tampão de lise acrescido de 3,3% de deoxicolato de sódio e 6,6% de Tween 40 e submetidos à nova centrifugação a 1.000 g para remoção completa de resquícios da fração citoplasmática. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi coletado como fração nuclear. As frações nucleares e citoplasmáticas foram ressuspendidas em 1 mL e 4 mL de TRizol (Invitrogen), respectivamente, e armazenadas a -80 oC.
3.12 Clonagem
Após amplificação dos transcritos de interesse por PCR, o produto da reação foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,7% contendo brometo de etídeo 0,5 g/mL em tampão TAE (Tris-Acetato 40mM, EDTA 1mM). O produto da reação foi visualizado em um fotodocumentador MiniBis Pro (DNR Bio-Imaging Systems) sob luz UV. As bandas correspondentes aos produtos de PCR obtidos foram cortadas do gel e purificadas com o kit Quiack Gel Extraction (Qiagen), de acordo com o protocolo do fabricante. Os produtos da PCR purificados foram clonados em pGEM-T Easy Vector System (Promega), de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, foi realizada diálise por 2 horas utilizando-se uma membrana VS de 0,025 µm (Millipore) para a remoção dos sais da reação. A reação dialisada foi utilizada para a transformação de células competentes de Escherichia coli, cepa DH10B (Invitrogen), por meio de eletroporação. Imediatamente após a eletroporação, 400 L de meio
SOC (bacto-triptona 20 mg/ml, extrato de levedura 5 mg/ml, NaCl 0,584 mg/ml, KCl 0,186 mg/ml, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, glicose 20 mM, pH 7,0) foram adicionados às
células, que foram incubadas a 37 oC por 1h. Posteriormente, as bactérias foram semeadas em meio LB-ágar (peptona de caseína 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%, ágar bacteriológico 1,4%, pH 7,0) contendo ampicilina (10 mg/mL), X-Gal 20 mg/ml (5-bromo-4- chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside) e IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 20 mg/ml e mantidas a 37 oC durante uma noite. As colônias selecionadas foram coletadas e inoculadas em 5 mL de meio LB líquido com ampicilina (10 mg/mL) a 37 oC, durante uma noite, com agitação constante. A extração do DNA plasmidial contendo o inserto foi realizada com o Plasmid Mini Kit (Qiagen), de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA obtido foi quantificado por sua densidade óptica a 260 nm e sua pureza foi atestada pela razão 260/280 nm. As medidas foram realizadas no espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Scientific). As construções foram utilizadas para a preparação dos vetores de transfecção do ensaio de promotor e super-expressão, como descrito a seguir nos itens 3.13 e 3.14 e para sequenciamento de produtos de amplificação por PCR.
O seqüenciamento foi realizado no aparelho ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems) conforme recomendações do fabricante, sendo que as reações de seqüenciamento foram realizadas com Big dye terminator mix (Perkin Elmer) de acordo com as instruções do fabricante.
3.13 Ensaio de promotor
Uma possível região promotora bidirecional que abrangia o sitio de inicio de transcrição (TSS) de ANRASSF1 (denominado promotor antissenso; está na fita mais do DNA genômico) e RASSF1C (denominado promotor senso; está na fita menos do DNA genômico) foi predita in silico no trabalho de (Davuluri et al. 2001), esquema na Figura A. Essas possíveis regiões promotoras foram amplificadas por PCR conforme descrito no item 3.6.1 utilizando oligonucleotídeos iniciados específicos (Tablea 1) e DNA genômico como molde,
clonadas no pGEM-T vector (Promega) conforme descrito item 3.12. Em seguida, foram excisadas desse vetor pelas endonucleases BglII e HindIII (New England Biolabs) conforme descrição do fabricante e foram inseridos no plasmídeo pGL3-Basic vector (Promega), previamente digerido com as mesmas endonucleases. As sequências dos promotores antissenso e senso foram inserida a montante da região do vetor pGL3 que codifica para a enzima Firefly luciferase do vagalume Photinus pyralis, que foi utilizada no ensaio de promotor. A ligação do produto da excisão no pGL3-Basic vector, transformação de bactérias competentes com o plasmídeos e extração dos vetores das bactérias foram realizadas conforme descrito no item 3.12.
Os ensaios de atividade promotora foram realizados na linhagem celular humana HeLa, cujas células foram semeadas em placas de 24 poços (4 x 105 células), e as transfecções foram realizadas com o reagente FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche), segundo instruções do fabricante. As células foram transfectadas em triplicatas biológicas com um dos plasmídeos pGL3_promotor-antissenso, pGL3_promotor-senso, pGL3-SV40 (controle positivo) ou pGL3-vazio (controle negativo) e todas foram co-transfectadas com o plasmídeo pRL-SV40 (Promega). Este último é utilizado para normalização da eficiência de transfecção, segundo protocol do fabricante.
Para avaliação da atividade de promotor, foi utilizado o sistema Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega), segundo instruções do fabricante. As reações foram realizadas em placa branca opaca (Falcon) de 96 poços e as medidas de emissão de luz foram obtidas em luminômetro MicroLumat Plus (Microplate Luminometer LB – Berthold Technologies) com o programa WinGlow (Berthold Technologies) utilizando-se os seguintes parâmetros: intervalo de medida 1 de 10 s, intervalo de medida 2 de 1 s e temperatura de 25 °C. A razão do valor obtido para cada medida das luciferases Firefly e Renilla de cada poço
foi calculada (Unidade Relativa de luz), assim como a média aritmética da razão de três réplicas da transfecção com cada plasmídeo.
3.14 Super-expressão
O transcrito ANRASSF1 foi amplificado por PCR conforme descrito item 3.6.1 utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos (Tabela 1) e como molde da amplificação foi utilizado cDNA proveniente de RT-fita específica do ANRASSF1 conforme descrito no item 3.5.2. O produto da reação de PCR foi clonado no pGEM-T vector (Promega) conforme descrito no item 3.12. Em seguida, foi excisado o ANRASSF1 desse vetor pelas endonucleases
KpnI e HindIII (New England Biolabs) conforme recomendação do fabricante e foi inserido no plasmídeo pCEP4 (Invitrogen), previamente digerido com as mesmas endonucleases. O vetor pCEP4 possui gene que confere resistência ao antibiótico Higromicina B, que foi utilizada na etapa de seleção das células transfectadas com os vetores. A ligação do produto da excisão no vetor pCEP4, transformação de bactérias competentes com o plasmídeos e extração dos vetor das bactérias foram realizadas conforme descrito no item 3.12.
Visando a super-expressão do ANRASSF1 de maneira estável, os vetores pCEP4_ANRASSF1 e pCEP vazio (controle) foram linearizados com a endonuclease NheI (New England Biolabs), conforme descrição fabricante. Células HeLa foram semeadas em placas de 6 poços (5x105 células) e mantidas em cultura até atingirem a confluência de 80%, e em seguida foram misturadas com 1,6 µg do vetor pCEP4 ANRASSF1 ou do vetor pCEP, linearizado, diluído no reagente FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche), segundo instruções do fabricante. Foram realizadas 3 transfecções independentes de cada construção, pCEP4 ANRASSF1 ou pCEP vazio (como controle).
Após 48 horas da transfecção, as células foram tratadas com 200 ng/ml de Higromicina B (Gibco), para selecionar as células transfectadas com o vetor pCEP4 que
confere as células resistência a Higromicina B. Como controle da seleção uma placa com células HeLa submetidas às mesmas condições de transfecção sem adição de vetor, foi submetida ao tratamento de Higromicina B. A seleção ocorreu com meio de cultura com antibiótico de 4 em 4 dias. A seleção foi mantida até uma semana após as células utilizadas como controle da seleção da transfecção terem 100% de morte celular quando observadas ao microscópio Axiovert 200 (Zeiss).
3.15 RNAi
Nos ensaios de supressão da expressão do lncRNA ANRASSF1, os oligonucleotídeos dupla-fita de RNA foram desenhados no BLOCK-iT™ RNAi Designer (Invitrogen) segundo protocolo do fabricante, utilizando somente os trechos de sequência que mapeiam nos introns do gene codificador de proteína RASSF1A do mesmo locus do lncRNA antissenso para evitar o silenciamento do transcrito maduro do gene codificador de proteína. Como controle negativo foram desenhados no mesmo programa siRNAs com a mesma composição de bases, porém em sequência embaralhada; as sequências dos siRNAs estão descritas na Tabela 3. As células HeLa foram transfectadas com um pool de 3 siRNA contra ANRASSF1 ou um pool de 3 siRNA controle na concentração total de 15 nM (5 nM cada siRNA) utilizando lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) conforme descrição do fabricante. Após 48 h do tratamento o RNA total das células em cultura foi extraído conforme descrito no item 3.2 e avaliada a expressão dos alvos por RT-qPCR conforme descrito nos itens 3.5.1 e 3.6.2.
Tabela 3. Sequências usadas no ensaio de siRNA
Alvo Nome do
oligonucleotídeo Sequência
ANRASSF1 stealth_ANRASSF_1 GGGAAAUCGGCAAUUAGAACGCUCC ANRASSF1 stealth_ANRASSF_1 GGAGCGUUCUAAUUGCCGAUUUCCC stealth_controle_1 GGGCUACGGUAAGAUCAACGAAUCC stealth_controle_1 GGAUUCGUUGAUCUUACCGUAGCCC ANRASSF1 stealth_ANRASSF_3 UGGAUCUCUAUCGCCUAGCACAGAA ANRASSF1 stealth_ANRASSF_3 UUCUGUGCUAGGCGAUAGAGAUCCA stealth_controle_3 UGGUCUCGCUAAUCCCACGAUAGAA stealth_controle_3 UUCUAUCGUGGGAUUAGCGAGACCA ANRASSF1 stealth_ANRASSF_2 CGACCUAUCUCAGUGGGUUACCUCA ANRASSF1 stealth_ANRASSF_2 UGAGGUAACCCACUGAGAUAGGUCG
stealth_controle_2 CGAAUCUCUGAGUGGUUCACCCUCA stealth_controle_2 UGAGGGUGAACCACUCAGAGAUUCG
3.16 Western blot
Células HeLa foram cultivadas em frascos apropriados até a confluência desejada, lavadas com PBS e descoladas da superfície do frasco por tratamento com 0,1% de tripsina seguido da adição de meio de cultura contendo SFB. Em seguida, as células foram sedimentadas por centrifugação a 325 x g por 5 minutos e o sobrenadante foi removido. O sedimento de células foi lavado com PBS, novamente sedimentado por centrifugação a 325 x g por 5 minutos e o sobrenadante foi removido. Em seguida, o sedimento de células foi ressuspenso em tampão de lise gelado (imidazol 20 mM (pH 7.2), EDTA1 mM, sacarose 250 mM com complete protease inhibitor cocktail (Roche)) e sonicado no aparelho Sonic Dismembrator Model 500 (Fischer Scientific), submetido a três pulsos de 10 segundos com amplitude de 30 % e intervalo de 30 segundos em gelo. A concentração das proteínas presentes no lisado foi determinada utilizando o BCA protein assay (Bio-Rad) conforme descrição do fabricante e a absorbância medida no espectrofotômetro SpectraMax Paradigm (Molecular Devices).
Quantidades iguais de proteínas (40 µg) foram separadas por SDS-PAGE com 10% de poliacrilamida, ao lado de um padrão de massa molecular de proteínas Prestained Protein
Marker (Fermentas) e posteriormente transferidas para uma membrana de nitrocelulose Hybond-C Extra (Amersham Biosciences) utilizando o transferidor semi-seco TE 77 PWR (Amersham Biosciences).
As membranas foram bloqueadas em 10 ml de solução de bloqueio (400 mg BSA /10 mL PBS; Sigma) durante 1 hora. Em seguida, foram incubadas com os anticorpos primários: anti-RASSF1A (Abcam – ab23950; na diluição 1:7500) e anti-actina (Millipore – mab1501 na diluição 1:9000) em uma nova solução de bloqueio por 16 hrs, sendo em seguida lavadas com PBS Tween 0,1%, uma vez por 15 minutos e duas vezes por 5 minutos. Após as lavagens as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário que é marcado com Alexa flúor 680 (Invitrogen) por 1 hora, e em seguida as lavagens descritas acima foram repetidas. O sinal de fluorescência foi analisado com Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences) e as intensidades foram quantificadas com Odyssey Software Aplicativo v3 (LI-COR Biosciences). O valor de densitometria foi definido como a razão entre as médias das medidas das intensidades de RASSF1A normalizadas pela actina, em cada condição (super-expressando
ANRASSF1 ou controle) em um total de três réplicas biológicas.
A significância estatística da diferença entre as condições comparadas foi medida utilizando o teste t de Student (pareado, bicaudal, homocedástico), considerando-se como limiar de significância p-valor <0,05.
3.17 Ensaio de proliferação
Para determinar se as células HeLa super-expressando ANRASSF1 ou depletadas de
ANRASSF1 por RNAi sofrem alteração do coeficiente de proliferação celular, por alteração dos níveis de RASSF1A, utilizamos o kit CellTiter 96 AQueous One Solution Cell
Proliferation Assay (Promega), um método colorimétrico de determinação do número de células viáveis, que foi realizado com duração de 48 hrs, conforme descrição do fabricante. Cada par de réplicas biológicas foi plaqueado na mesma placa de 96 poços e três réplicas foram testadas tanto nos ensaios de super-expressão como RNAi. O coeficiente de proliferação foi avaliado pela medida de absorbância de formazan nos tempos de 24 e 48 hrs, como recomendado no kit CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) no espectrômetro SpectraMax Paradigm (Molecular Devices). O coeficiente de proliferação foi definido como a razão entre as médias das medidas dos tempos de 48 hrs e 24 horas. No caso do ensaio de proliferação juntamente com RNAi (item 3.14), após 24 hrs da transfecção dos siRNA a proliferação foi avaliada conforme descrito acima. A significância estatística da diferença entre as condições comparadas foi medida utilizando o teste t de
Student (pareado, bicaudal, homocedástico), considerando-se como limiar de significância p- valor <0,05.